酸化ストレスに対する防御機能を有する人工赤血球製剤の創製と体内評価

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H02087
• 研究機関: 奈良県立医科大学
• 研究代表者: 酒井 宏水 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (70318830)
• 研究分担者: 松平 崇 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (20570998) ; 山本 惠三 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (90254490)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 人工赤血球 / 解糖系酵素 / NADH / メチレンブルー / 一酸化炭素 / リポソーム / 酸素輸送 / 虚血

研究実績の概要

① NADHによるmetHb生成の抑制の機序に関する検討：NAD(P)HがHbと共存するとき、擬似カタラーゼ活性、擬似SOD活性を示すこと、また、IHPや2,3-DPGが拮抗阻害作用を示すことと、ドッキングシミュレーションから、Hbに対する結合部位が想定された。NADHとHbの結晶化を試みたが、未だ結晶化は成功しておらず、部位の特定には至っていない。しかし、31P-NMRにより、1:1比で結合していること、α鎖の方がβ鎖よりもNADHの保護効果を受けやすいことなど多角的検討から、α鎖に結合していることが確実と考えられた。この成果は、Biochemistry誌に掲載された。

② 赤血球解糖系の電子エネルギーの活用によるmetHbの間接的な酵素的還元：赤血球が産生する電子エネルギーを用いて、メチレンブルー(MB)の投与によってこれを引出し、HbV粒子内のmetHbを還元することについて、MBよりも優れたPhenothiazine系の電子伝達物質を見出した。そこで、Wistar系雄性ラットを用いHbVによる出血性ショック蘇生後にこの色素を投与し、メト化抑制効果を検討したところ、Azure BがMBよりも優れた効果を示すことが明らかになった。

③ CO中毒モデルの脳神経系への影響の精査と、CO-HbV投与の影響との比較：3000 ppmのCOガスに暴露されたWistar系ラットについて、循環動態、血液ガス組成、脳組織病理の変化を得たので、CO-HbVを投与した場合と比較検討を進め、CO-HbVの毒性は極めて軽微であることが明らかになってきた。そこで、出血性ショック蘇生モデルに投与し、脳組織保護効果を期待する試験を進めている。また、脊髄虚血性モデルを作成し、CO-HbVの投与効果をみる検討では、まだ例数が十分ではないが、保護効果を示すデータが得られ始めている。次年度も引き続き検討する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

NADHによるmetHb生成の抑制の機序に関する研究では、次の論文発表に至った。M. Yamada, T. Matsuhira, K. Yamamoto, H. Sakai. Antioxidative pseudo-enzymatic mechanism of NAD(P)H coexisting with oxyhemoglobin for suppressed methemoglobin formation. Biochemistry, 58(10), 1400-1410 (2019).

また、赤血球解糖系の電子エネルギーの活用によるmetHbの間接的な酵素的還元については、生体内評価の結果が次の論文として発表された。S. Ghirmai, L. Bulow, H. Sakai. In vivo evaluation of electron mediators for the reduction of methemoglobin encapsulated in liposomes by using electron energies produced by red blood cell glycolysis. Artif. Cells, Nanomedicine, Biotechnol.46(7), 1364-1372 (2018).

CO中毒モデルの脳神経系への影響の精査と、CO-HbV投与の影響との比較についても、CO-HbVの毒性がなかったことが明確になってきたので、効能をみる試験に集中する予定である。

今後の研究の推進方策

NADHによるmetHb生成の抑制の機序に関する研究では、HbとNADH共存系の結晶の生成を継続して検討する。

赤血球解糖系の電子エネルギーの活用による人工赤血球中のmetHbの間接的な酵素的還元については、引き続き出血性ショック蘇生モデルを用い、電子伝達系の用法について検討する。

CO-HbVについては、COの効能をみる試験、NADH内包CO-HbVの投与の影響を検討する試験に集中する。

研究成果

• [国際共同研究] Lund University(スウェーデン)
  • 国名: スウェーデン
  • 外国機関名: Lund University
• [雑誌論文] Antioxidative Pseudoenzymatic Mechanism of NAD(P)H Coexisting with Oxyhemoglobin for Suppressed Methemoglobin Formation. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamada M, Matsuhira T, Yamamoto K, Sakai H
  • 雑誌名: Boichemistry 巻: 58 ページ: 1400-1410
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.8b01314
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo evaluation of electron mediators for the reduction of methemoglobin encapsulated in liposomes using electron energies produced by red blood cell glycolysis. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ghirmai S, Bulow L, Sakai H
  • 雑誌名: Artif Cells Nanomed Biotechnol. 巻: 46 ページ: 1364-1372
  • DOI: 10.1080/21691401.2017.1397003
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] 人工赤血球（ヘモグロビン ベシクル）製剤の新しい利用法 (2018)
  • 著者名/発表者名: 酒井宏水
  • 雑誌名: 日本輸血細胞治療学会誌 巻: 64 ページ: 589-596
  • DOI: https://doi.org/10.3925/jjtc.64.589
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 輸血代替の他にもさまざまな利用が期待される「人工赤血球」とは (2018)
  • 著者名/発表者名: 酒井宏水
  • 雑誌名: Medical Technology 巻: 46 ページ: 832-834
• [雑誌論文] 蛍光偏光解消法による高濃度蛋白質溶液を内包したリポソーム脂質膜の流動性評価. (2018)
  • 著者名/発表者名: 久禮智子、酒井宏水
  • 雑誌名: Jasco Report 巻: 60 ページ: 34-41
• [雑誌論文] 人工赤血球の開発と臨床応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 酒井宏水, 奥田千愛, 久禮智子
  • 雑誌名: LiSA (Life Support and Anesthesia) 巻: 25 ページ: 1139-1146
• [学会発表] Translational Research of Artificial Red Cells for a Transfusion Alternative and O2/CO Therapeutics (2019)
  • 著者名/発表者名: Hiromi Sakai
  • 学会等名: 6th World Congress on Nanomedical Sciences (ISNSCON 2018)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 人工赤血球(ヘモグロビンベシクル)製剤の新しい利用法 (2018)
  • 著者名/発表者名: 酒井宏水
  • 学会等名: 第66回日本輸血細胞治療学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 人工赤血球製剤の生体適合性：非臨床試験による安全性の評価 (2018)
  • 著者名/発表者名: 酒井宏水
  • 学会等名: 第25回日本血液代替物学会年次大会
  • 招待講演
• [学会発表] Present Status of Blood Substitute Research in Japan (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiromi Sakai
  • 学会等名: Symposium: “Transportador artificial de oxigeno” / Academia Nacional de Medicina de Mexico
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 人工赤血球(ヘモグロビンベシクル)の医療応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 酒井宏水
  • 学会等名: MBTオープンミーティング2018 in 東京
  • 招待講演
• [備考] 奈良県立医科大学医学部化学教室
  • URL: http://www.naramed-u.ac.jp/~chem/