| 研究実績の概要 |
前年度までに得られていたミトコンドリア（Mito）に内在するミオグビン（Mb）タンパク質の検出について、低張液処理後の上清のサンプル処理に超遠心分離（220,000 g）を施し、その分離精度を高めることを試行した。結果、破断した外膜（フラグメント）を分離し、より純度を高めた膜間腔画分を得ることができた。そのサンプルからMbタンパク質の検出ができたため、低張液処理によってMbがMito外へ放出されたこと、また、内在していたMbは膜間腔領域に存在していたか、その一部は内膜に相互作用していたことが明らかとなった。また、昨年度から培養筋芽細胞（C2C12）を用いてMito内のMbを検出するモデルを構築しようと試みていたが、元々の発現量が少ないC2C12ではMbの検出感度が良好ではなく、分化誘導後の日数を時系列で評価するなどの方法から条件検討を行った。その結果、分化誘導後の日数を延長することによって、単離Mitoに内在するMbを検出できるようになった。今後は、Mito外膜に存在するトランスロカーゼ（TOM 複合体）の一部をノックダウンすることによって、MbのMito内在量の変化を検証しようと考えている。また、Mitoの発現因子の探索では、C2C12細胞を用いて試験した。ロイシン添加（3 mM×24-h）がC2C12細胞のMito生合成を上方調節し、その背後でmicroRNA（miR-494, miR-696）の発現がロイシンによって抑制されていた。そこで挙動を示したmicroRNAsを過剰発現させたC2C12細胞ではPGC1α mRNAやmtDNA数などが抑制され、ロイシン添加によって、その抑制がレスキューされた。つまり、運動刺激によって応答するmicroRNAsの一部をロイシンのような基質もMito生合成を制御している可能性が示唆された。
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