| 研究課題/領域番号 |
17H02201
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
蓮見 惠司 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (20208474)
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| 研究分担者 |
鈴木 絵里子 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (00468513)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | Epoxide hydrolase / Inhibitor / Substrate / Lipid mediator |
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| 研究実績の概要 |
Ephx2によりコードされる二機能性酵素EPHX2（soluble epoxide hydrolase; sEH）は、N末端領域に脂質リン酸エステルホスファターゼ（Nterm-phos）、C末端領域に脂質エポキシドハイドロラーゼ（Cterm-EH）活性を有する。従来、sEHによる炎症制御はCterm-EHに依存すると考えられてきたが、最近我々はNterm-phosが血管内皮の炎症制御に決定的な役割を果たすことを明らかにした。一方、Nterm-phosの生理的基質や炎症制御の機序は不明である。本研究では、Nterm-phosの生理的基質および阻害剤の同定を通じて、Nterm-phosを介した炎症制御機序の解明と阻害剤の薬理作用の検証を目的として以下の研究を行った。
（1）Nterm-phosの生理的基質の探索
1）モデル脂質としてdodecyl phosphateを用いてdansyl chlorideによる標識効率を検討し、定量的に反応が進行する条件を決定した。2）Nterm-phos阻害剤投与あるいは生理食塩水投与マウスの臓器（肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、肺等）から極性脂質、非極性脂質画分を調製した。3）Nterm-phosの基質と生成物の構造的特徴に基づく前処理方法開発と、イオン化条件の最適化を行い、LC-MSによる網羅的一斉解析方法を開発した。4）調整した脂質を以下の3条件（阻害剤なし、Cterm-EHあるいはNterm-phos阻害剤存在下）でsEH処理し、dansyl chlorideで標識、LC-MSで一斉分析し、前述の3条件で強度の差を認めるイオンピークを同定した。
（2）Nterm-phos選択的阻害剤の探索：これまでに得た各種N修飾アミノ酸の構造活性相関をベースとして、活性の強い阻害剤を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（1）Nterm-phosの生理的基質の探索
1）タグ化反応条件の検討：モデル脂質としてdodecyl phosphateを用いてdansyl chlorideによる標識効率を検討し、定量的に反応が進行する条件を決定した。2）基質として用いる生体脂質の調製：Nterm-phos阻害剤投与あるいは生理食塩水投与マウスの臓器（肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、肺等）から極性脂質、非極性脂質画分を調製した。3）LC-MSを用いる網羅的一斉解析方法の検討：Nterm-phosの基質と生成物の構造的特徴に基づく前処理方法開発と、イオン化条件の最適化を行い、LC-MSによる網羅的一斉解析方法を開発した。4）基質候補分子の探索：調整した脂質を以下の3条件（阻害剤なし、Cterm-EHあるいはNterm-phos阻害剤存在下）でsEH処理し、dansyl chlorideで標識、LC-MSで一斉分析し、前述の3条件で強度の差を認めるイオンピークを同定した。6）基質候補分子の推定：項目5で得たイオンピークの精密質量を基にデータベース検索を行い、候補分子を推定した。
（2）Nterm-phos選択的阻害剤の探索
1）候補化合物の絞り込み：これまでに得た各種N修飾アミノ酸の構造活性相関をベースとして、活性の強い阻害剤を同定した。2）いくつかの有望化合物の阻害機序を解析した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は以下の検討を行う。
（1）sEH Nterm-phosの生理的基質の探索：1）より多くの候補分子の情報を得るため、昨年度から引き続きNterm-phosの基質候補分子、反応産物候補分子の探索を行う。2）LC-MSを用いる網羅的一斉解析： 項目1）で調整した極性脂質画分（＝基質候補分子プール）および非極性脂質画分（＝反応産物候補分子プール）を、直接、あるいはダンシル誘導対化の後にLC-MS/MSによる一斉分析に供し、Nterm-phos阻害剤投与マウスおよび非投与の対照マウス由来のサンプルの間の差が認められる物質を候補分子として選択する。3）基質候補分子および反応産物候補分子の同定：項目2）で得られて候補分子の精密質量を用いてデータベース検索し、候補分子の同定を試みる。
（2）Nterm-phos選択的阻害剤の探索：1）探索の結果得られた候補化合物のいくつかを用いて生化学解析を行い、Nterm-phos選択的阻害剤であることの確認と、速度論解析から阻害様式の解明を行う。2）得られた成果を取りまとめて論文発表する。
（3）阻害剤の薬理作用の解析：1）阻害剤の作用の検証： Nterm-phos阻害によりもたらされると予測されるLcn2発現誘導が、選択した阻害剤で引き起こされるか、培養細胞レベルおよび動物レベルで起こるか検証する。
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