タンパク質膜挿入・膜透過に関与する糖脂質酵素MPIaseの構造と機能に関する研究

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H02209
• 研究機関: 岩手大学
• 研究代表者: 西山 賢一 岩手大学, 農学部, 教授 (80291334)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: タンパク質膜挿入 / MPIase / CdsA / YidC

研究実績の概要

大腸菌におけるタンパク質膜挿入・膜透過反応には、糖脂質MPIaseが重要な役割を果たしている。膜タンパク質の膜挿入反応はMPIaseによって触媒されるため、MPIaseは「糖脂質酵素（Glycolipozyme）」であるという概念を提唱している。CdsAはリン脂質生合成にかかわる因子であり、CTPとフォスファチジン酸（PA）からCDP-DAGを生合成することが知られている。大腸菌においてはCDP-DAGはすべてのリン脂質の前駆体となる。MPIase生合成中間体GlcNAc-PP-DAG（Compound I）は、CdsA上でCDP-DAGが生合成され、CdsAから解離する前にGlcNAc-Pが取り込まれることにより生成することを見出した。実際、CdsAとPAを含むプロテオリポソームにCTPとGlcNAc-Pを加えると、これらの因子に依存してCompound Iが生成することを、LC-MS解析で明らかにした。さらに、この反応を進行させるためには、大腸菌内膜由来の因子が必要であることを見出した。Compound I生成を指標にこの因子の精製を進めたところ、YncLタンパク質を同定した。YncLは分子量約3.5kDaの膜タンパク質であることが判明した。YncLを過剰発現した株では、MPIaseの発現量の増加が観察されたため、YncLはCDP-DAGのGlcNAc-Pを取り込んでCompound Iを生成するのに必要な因子であると考えられる。
タンパク質膜挿入の再構成系では、自発的膜挿入を完全に排除した再構成系を確立した。この系を用いて解析した結果、すべてのタンパク質はMPIaseに依存して膜挿入すること、MPIase依存の膜挿入はYidCにより促進されることが判明した。さらに、YidCの変異体を用いた解析では、膜挿入促進効果が損なわれることが判明した。YidCには膜内部に親水的な溝があり、その中心部分にアルギニン残基が存在する。この部分に変異を導入した場合、MPIase依存の膜挿入を促進する効果が著しく低下した。この残基がYidC機能に重要であることを再構成系でも確認することができた。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

MPIase生合成酵素CdsAやYnbBに関する論文をまとめ、MPIaseがin vivoでもタンパク質膜挿入反応に必須であることを示すことができた。続いて、MPIase生合成酵素の一つ、YncLを同定できた。さらには、再構成系でYidCの機能解析を進めることに成功し、論文投稿した。そのほかにも7報の論文が出版・受理され、4報の論文が投稿中・改訂中である。

今後の研究の推進方策

MPIaseの生合成酵素の探索を続行して、MPIase生合成経路の全貌を明らかにする。前年度同定したYncLの変異株を構築し、MPIase生合成に及ぼす影響を調べる。精製MPIaseやSecYEG、YidCを用いて、それらの相互作用部位を決定する。MPIaseと基質膜タンパク質との相互作用についても調べる。

研究成果

• [雑誌論文] Expression of alcohol oxidase gene from Ochrobactrum sp. AIU 033 in recombinant Escherichia coli through the twin-arginine translocation pathway (2019)
  • 著者名/発表者名: Matsumura Kenji、Yamada Miwa、Yamashita Takeshi、Muto Hitomi、Nishiyama Ken-ichi、Shimoi Hitoshi、Isobe Kimiyasu
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: 128 ページ: 13～21
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2018.12.012
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Increased expression of the bacterial glycolipid MPIase is required for efficient protein translocation across membranes in cold conditions (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawasato Katsuhiro、Suzuki Sonomi、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 294 ページ: 8403～8411
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.008457
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] YnbB is a CdsA paralogue dedicated to biosynthesis of glycolipid MPIase involved in membrane protein integration (2019)
  • 著者名/発表者名: Sato Ryo、Sawasato Katsuhiro、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 510 ページ: 636～642
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.01.145
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CdsA is involved in biosynthesis of glycolipid MPIase essential for membrane protein integration in vivo (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawasato Katsuhiro、Sato Ryo、Nishikawa Hanako、Iimura Naoki、Kamemoto Yuki、Fujikawa Kohki、Yamaguchi Toshiyuki、Kuruma Yutetsu、Tamura Yasushi、Endo Toshiya、Ueda Takuya、Shimamoto Keiko、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: No 1372
  • DOI: 10.1038/s41598-018-37809-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Free energy profiles of lipid translocation across pure POPC and POPC/CHOL bilayer : all - atom molecular dynamics study (2019)
  • 著者名/発表者名: Saito Hiroaki、Morishita Tetsuya、Mizukami Taku、Nishiyama Ken-ichi、Kawaguchi Kazutomo、Nagao Hidemi
  • 雑誌名: Journal of Physics: Conference Series 巻: - ページ: in press
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Enzyme-like glycolipids MPIase involved in membrane protein integration of E. coli (2019)
  • 著者名/発表者名: Kohki Fujikawa, Ken-ichi Nishiyama and Keiko Shimamoto
  • 雑誌名: Trends in Glycoscience and Glycotechnology 巻: - ページ: in press
  • DOI: 10.4052/tigg.1705.1E
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 大腸菌膜タンパク質の膜挿入に関与する酵素様糖脂質MPIase (2019)
  • 著者名/発表者名: 藤川 紘樹、西山 賢一、島本 啓子
  • 雑誌名: Trends in Glycoscience and Glycotechnology 巻: - ページ: 印刷中
  • DOI: 10.4052/tigg.1705.1J
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cholesterol blocks spontaneous insertion of membrane proteins into liposomes of phosphatidylcholine (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Shota、Suzuki Sonomi、Saito Hiroaki、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: The Journal of Biochemistry 巻: 163 ページ: 313～319
  • DOI: 10.1093/jb/mvx083
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular dynamics study of binary POPC bilayers: molecular condensing effects on membrane structure and dynamics (2018)
  • 著者名/発表者名: Saito Hiroaki、Morishita Tetsuya、Mizukami Taku、Nishiyama Ken-ichi、Kawaguchi Kazutomo、Nagao Hidemi
  • 雑誌名: Journal of Physics: Conference Series 巻: 1136 ページ: 012022～012022
  • DOI: 10.1088/1742-6596/1136/1/012022
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Syntheses and Activities of the Functional Structures of a Glycolipid Essential for Membrane Protein Integration (2018)
  • 著者名/発表者名: Fujikawa Kohki、Suzuki Sonomi、Nagase Ryohei、Ikeda Shiori、Mori Shoko、Nomura Kaoru、Nishiyama Ken-ichi、Shimamoto Keiko
  • 雑誌名: ACS Chemical Biology 巻: 13 ページ: 2719～2727
  • DOI: 10.1021/acschembio.8b00654
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] タンパク質膜挿入・膜透過に関与する糖脂質MPIaseの構造と機能 (2019)
  • 著者名/発表者名: 西山賢一
  • 学会等名: 理学部講演会（山形大学、山形市）
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質膜挿入・膜透過に関与する糖脂質MPIase の構造と機能 (2019)
  • 著者名/発表者名: 西山賢一
  • 学会等名: 第１回細胞形成研究会（岩手大学、盛岡市）
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質膜挿入に必須の糖脂質MPIaseの生合成機構の解明とin vivoにおける機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 沢里克宏、西山賢一
  • 学会等名: 第１回細胞形成研究会（岩手大学、盛岡市）
• [学会発表] 大腸菌のタンパク質輸送システムの改変を目指したMPIaseの構造と機能の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 鈴木苑実、藤川絋樹、島本啓子、池田汐里、西山賢一
  • 学会等名: 第４回デザイン生命工学研究会（早稲田大学TWINS、新宿区）
• [学会発表] タンパク質膜挿入に関与する糖脂質酵素MPIaseの生合成中間体の生成機構 (2019)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、川上真由、藤川紘樹、島本啓子、西山賢一
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年度大会（東京農業大学、世田谷区）
• [学会発表] 大腸菌の膜タンパク質膜挿入機構解明を目指した蛍光標識MPIase類縁体の合成 (2019)
  • 著者名/発表者名: 藤川紘樹、梅川雄一、西山賢一、島本啓子
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年度大会（東京農業大学、世田谷区）
• [学会発表] Bacterial CdsA and eukaryotic Cds1p are involved in biosynthesis of MPIase, a glycolipozyme essential for membrane protein integration (2018)
  • 著者名/発表者名: Yuki Kamemoto, Ryo Sato, Katsuhiro Sawasato, Naoki Iimura, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: International Symposium on Innovative Agriculture and Fishery (ISIAF2018) (Iwate University, Morioka)
  • 国際学会
• [学会発表] タンパク質膜挿入に関与する糖脂質酵素MPIase生合成におけるCdsAの機能の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、佐藤諒、沢里克宏、川上真由、西山賢一
  • 学会等名: 日本生化学会東北支部第84回例会（岩手医科大学薬学部、岩手県矢巾町）
• [学会発表] タンパク質膜挿入反応に必須の糖脂質酵素MPIaseの部分化学合成標品を用いた構造と機能の研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木苑実、藤川絋樹、島本啓子、池田汐里、西山 賢一
  • 学会等名: 日本生化学会東北支部第84回例会（岩手医科大学薬学部、岩手県矢巾町）
• [学会発表] 糖脂質酵素 MPIase生合成における CdsAの機能 (2018)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、佐藤諒、沢里克宏、川上真由、西山賢一
  • 学会等名: 第 15 回 21 世紀大腸菌研究会（山形座瀧波、山形県南陽市）
• [学会発表] タンパク質膜挿入に必須の糖脂質酵素MPIaseの部分化学合成標品を用いた構造と機能の研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木苑実、藤川絋樹、島本啓子、池田汐里、西山 賢一
  • 学会等名: 第 15 回 21 世紀大腸菌研究会（山形座瀧波、山形県南陽市）
• [学会発表] 糖脂質MPIaseはTAT（Twin-Arginine Translocation）膜透過反応に必須である (2018)
  • 著者名/発表者名: 西川華子、菅野琴華、沢里克宏、山田美和、菊池慶実、西山賢一
  • 学会等名: 第 15 回 21 世紀大腸菌研究会（山形座瀧波、山形県南陽市）
• [学会発表] タンパク質膜挿入に必須の糖脂質MPIaseの生合成におけるCDPジアシルグリセロール合成酵素の機能の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、佐藤諒、沢里克宏、川上真由、西山賢一
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会（国立京都国際会館、京都市）
• [学会発表] タンパク質膜挿入反応に関わる糖脂質酵素MPIaseの構造と機能の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木苑実、藤川絋樹、池田汐里、島本啓子、西山賢一
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会（国立京都国際会館、京都市）
• [学会発表] Increase in the expression level of Glycolipozyme MPIase is required for the efficient protein translocation in the cold (2018)
  • 著者名/発表者名: Katsuhiro Sawasato, Sonomi Suzuki, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: Bacterial Protein Export 2018 (The Leuven Ibstitute for Ireland, Leuven, Belgium)
  • 国際学会
• [学会発表] MPIase, a glycolipid essential for protein integration, is involved in the TAT pathway (2018)
  • 著者名/発表者名: Hanako Nishikawa, Kotoka Kanno, Katsuhiro Sawasato, Miwa Yamada, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: Bacterial Protein Export 2018 (The Leuven Ibstitute for Ireland, Leuven, Belgium)
  • 国際学会
• [学会発表] YidC accelerates glycolipozyme MPIase-dependent integration of membrane proteins (2018)
  • 著者名/発表者名: Masaru Sasaki, Hanako Nishikawa, Sonomi Suzuki, Michael Moser, Katsuhiro Sawasato, Hideaki Matsubayashi, Kaoru Kumazaki, Tomoya Tsukazaki, Yutetsu Kuruma, Maria Huber, Osamu Nureki, Takuya Ueda, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: Bacterial Protein Export 2018 (The Leuven Ibstitute for Ireland, Leuven, Belgium)
  • 国際学会
• [学会発表] Glycolipozyme MPIase is essential for membrane protein integration and facilitates protein translocation in Escherichia coli (2018)
  • 著者名/発表者名: Katsuhiro Sawasato, Ryo Sato, Hanako Nishikawa, Naoki Iimura, Yuki Kamemoto, Kohki Fujikawa, Toshiyuki Yamaguchi, Yutetsu Kuruma, Yasushi Tamura, Toshiya Endo, Takuya Ueda, Keiko Shimamoto, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: Bacterial Protein Export 2018 (The Leuven Ibstitute for Ireland, Leuven, Belgium)
  • 国際学会
• [学会発表] Structure and function of MPIase involved in membrane protein integration and preprotein translocation (2018)
  • 著者名/発表者名: Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: BMB Seminar (Freiburg University, Germany)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] タンパク質膜挿入を触媒する糖脂質酵素MPIaseの中間体の生合成機構の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、佐藤諒、川上真由、藤川紘樹、島本啓子、西山賢一
  • 学会等名: 第13回無細胞生命科学研究会（愛媛大学、松山市）
• [備考] 岩手大学農学部応用生物化学科分子生物学研究室
  • URL: http://news7a1.atm.iwate-u.ac.jp/~sec/