| 研究課題/領域番号 |
17H03092
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
當舎 武彦 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (00548993)
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| 研究分担者 |
新井 博之 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (70291052)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 脱窒 / タンパク質複合体 / 金属タンパク質 / 電子顕微鏡 / 一酸化窒素 / ヘム |
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| 研究実績の概要 |
脱窒タンパク質複合体の電子顕微鏡による構造解析を進めるために、脱窒過程に含まれる膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）と亜硝酸還元酵素（NiR）の複合体に着目し、試料の調製法の検討を行った。緑膿菌からNORとNiRのれぞれを精製し、両者を混合したものについて、膜タンパク質の電子顕微鏡試料の調製に有効であるとされているGradient-based Detergent Removal（GraDeR）を行った。GraDeR処理後、試料のネガティブステインを行い電子顕微鏡により観察した。その結果、長辺が200オングストローム程度の粒子を確認することができた。既に明らかにしているNORおよびNiRの構造と大きさから、得られた電顕像は、NORとNiRの複合体であることが示唆された。この結果は、GraDeRが脱窒タンパク質複合体の調製に有効な手法であることを示している。しかし、本測定条件では、NOR-NiR複合体に由来すると考えられる粒子に加えて、より小さなNORもしくは、NiR単体と予想される粒子も多くみられた。NOR-NiR複合体を安定に形成させるために、更なる条件検討が必要である。
変異体解析や動態解析に向けての脱窒タンパク質の発現系の構築にも取り組んだ。NORの緑膿菌を用いた発現系を参考にし、NiRの発現ベクターを設計した。設計したNiRの発現ベクターを緑膿菌のNiR欠損株に導入したところ、緑膿菌NiR欠損株は、脱窒条件で生育できないのに対し、NiRの発現ベクターを組み込んだ緑膿菌NiR欠損株は、野生株同様に脱窒条件で生育できることが確認できた。この結果は、設計したNiRの発現ベクターが緑膿菌内で機能し、活性をもったNiRが発現できていることを意味しており、同様の系を用いることで、他の脱窒タンパク質の発現系も構築可能であることを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
試料の調製については、過去に取り組んできたNORの発現系構築のノウハウをいかすことで、これまで困難であったNiRの発現系が構築できた。他の脱窒タンパク質についても、本課題を通じて得た知見をもとに発現系が構築できると考えられ、変異体解析に向けての土台を築くことができたといえる。
昨年度は、既にX線結晶構造解析により複合体の構造解析を行うことができているNOR-NiR複合体をモデル系とし、電子顕微鏡での構造解析に適した試料調製法の検討を行った。緑膿菌から精製したNORとNiRを混合し、ネガティブステインを行った場合、NOR-NiR複合体と考えられるサイズの大きな粒子が観測されたが、それ以外に、凝集を起こした試料や、界面活性剤ミセルと考えられる粒子が多数みられた。そこで、試料調製法を改善するために、膜タンパク質試料の調製に効果的であるとされるGraDeRをNOR-NiR複合体に適用した。GraDeRは、試料に含まれる界面活性剤ミセルの除去に有効であるが、NOR-NiR複合体をGraDeRで処理すると、複合体の形成度合も検討できることがわかった。GraDeR処理後の試料にネガティブステインを施し、電子顕微鏡で観測したところ、NOR-NiR複合体由来と考えられる粒子を明確に観測することができた。現在のところ、観察した粒子数が少なく構造解析には至っていないが、GraDeRが複合体の単離および電子顕微鏡観察のための試料調製に効果的であることがわかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
第一に安定に脱窒タンパク質複合体を単離する手法の確立を目指す。既に明らかにしているNOR-NiR複合体の結晶構造から、NORとNiRの相互作用には、脂質二重膜の存在が重要であることが示唆されている。そこで、人工脂質二重膜を形成することのできるナノディスクを利用することで、脱窒タンパク質複合体を安定に形成させる。また、近年開発された膜タンパク質を脂質に囲まれたまま可溶化するリポディスクという手法も取り入れ、脱窒タンパク質複合体の単離を目指す。脱窒タンパク質複合体を安定に形成することができるようになれば、ネガティブステインによる複合体の構造解析に取り組む。
これまで、脱窒過程で生じる中間生成物である一酸化窒素NOの細胞毒性が高いことに注目し、NOを生成するNiRとNOを分解するNORが複合体を形成することでNOを拡散させずに分解していることを発見してきた。同様に考えるとNOと同様細胞毒性の高い亜硝酸の合成や輸送、分解に関わるタンパク質が複合体を形成していると考えられる。そこで、亜硝酸の生成を行う硝酸還元酵素（Nar）、亜硝酸を細胞質からペリプラズムに輸送する硝酸・亜硝酸交換輸送体（NarK）および亜硝酸を分解するNiRに注目した研究を展開する。これまでに、NiRの発現系が構築できているので、その知見をいかし、NarおよびNarKの発現系を構築し、Nar、NarKおよびNiR複合体の形成について検討する。複合体の形成が確認できれば、その構造解析にも着手し、相互作用部位の変異体解析を行うなど、機能解析にも取り組む。
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