オートファジーのストレス・情動系関与についての機能形態学的研究

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H03553
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 田中 雅樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80264753)
• 研究分担者: 渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990) ; 辻村 敦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50236890) ; 田口 勝敏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60462701)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: オートファジー / 遺伝子改変マウス / NPYニューロン / 側坐核 / RNA編集

研究実績の概要

オートファジーは細胞内タンパク質分解機構の一つで神経変性疾患などへの関与が知られているが、本研究ではストレス・情動系へのオートファジー関与をストレスモデル、遺伝子改変マウスを用いて明らかにすることを目的とする。令和１年度は昨年度新たに作成した5系統（GFP-LC3-RFP）のトランスジェニックマウスについてオートファジー活性化をモニターできるかをスクリーニングしようとした。しかし繁殖に時間がかかり、ようやくヘテロ段階で１系統にGFP、RFPの軽度発現がみられた。今年度はこの系統のホモマウスを作成してオートファジー活性を、初代培養細を作成して確認した後、ストレス・情動に関わる脳領域でオートファジーfluxによる活性化をモデル動物を作製して組織・細胞レベルで解析する予定である。
側坐核NPYニューロンの情動行動に果たす役割を解析するために、NPY-CreマウスとDREADDテクノロジーを用いて、AAVウイルスベクター投与により、側坐核NPYニューロンの活性化を行うとオープンフィールド試験や高架式十字迷路試験で抗不安効果が認められた。また側坐核NPYニューロンをNPY-Creマウスを用いて、ヒトジフテリア毒素で破壊すると不安行動を示し、側坐核NPYは抗不安作用を持つことが示された。以上の成果をExperimental Neurology誌に発表した (ePublish, 2020)。
また、昨年度は側坐核のRNA編集を抑えるとマウス飲酒行動が抑制される論文(Frontiers in Behavioral Neuroscience, 2019) と年末に側坐核の5-HT2C受容体のRNA編集がアルコール嗜好性に関与する総説をFrontiers in Neuroscience誌に発表した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

新たに神経特異的なオートファジー活性を測定するためのレポーターシステムを発現したマウス（GFP-LC3-RFP）を作製したが、なかなか思うように成育せず妊娠繁殖に時間がかかった。そのため5系統のヘテロトランスジェニックマウスを、実際にin vivo でオートファジーを細胞レベルで可視化できるか、詳細な検討を行った。そのうち１系統のヘテロマウスが弱い蛍光ながら、オートファジーをモニターできそうなので、2020年度はこの系統のホモマウスを用いたストレスモデルのオートファジー解析を行う予定である。その間NPY-Creマウスを用いた情動モデルの検索も同時並行で行う予定である。

今後の研究の推進方策

１．新たに作製したGFP-LC3-RFPのホモマウスに対して、まず、レポーターシステムの確認のために海馬神経細胞初代培養系を作製し、オートファジー活性化剤であるラパマイシンを投与して緑色と赤色の比率が変化するのを可視化できるのかを確認する。次にマウス脳内にラパマイシンをインジェクションして局所にオートファジーの活性化が可視化できるかを、蛍光抗体を用いた組織化学法で確認する。
２．GFP-LC3-RFPマウスを用いてストレスによる脳内オートファジー活性の変化を調べる。具体的には、拘束ストレス（8時間）やフットショックストレス（0.4mA, 4回）を受けたマウスを4%パラホルムアルデヒドで固定を行い、作製した脳切片の扁桃体、側坐核、海馬、視床下部等の神経でのオートファジー活性の変化を観察する。さらに、一過的なストレス以外にも社会敗北型ストレスモデルや慢性疼痛モデルも作製し同様の解析を行う。
３．抗マラリア薬メフロキンはクロロキンと同様オートファジーを抑制するが、副作用としてうつ状態など、精神異常をきたすことが知られている。経口メフロキン投与したマウスを用いて、行動解析と脳辺縁系や前頭前皮質におけるオートファジー活性を解析する。
４．情動・摂食に関与する神経ペプチドNPYは生体のエネルギー状態に応じてオートファジーを起こすことが報告されている。我々はNPY特異的にCreを発現するマウスを飼育しており、NPY-CreマウスとGFP-LC3-RFPマウスを交配し、視床下部NPYニューロンを、DREADD法を用いて特異的に刺激した時にオートファジーが起こるかを脳内でモニターする。

研究成果

• [雑誌論文] Neuropeptide Y neurons in the nucleus accumbens modulate anxiety-like behavior (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamada S, Islam MS, van Kooten N, Bovee S, Oh YM, Tsujimura A, Watanabe Y and Tanaka M.
  • 雑誌名: Experimental Neurology 巻: 327 ページ: -
  • DOI: 10.1016/j.expneurol.2020
  • 査読あり
• [雑誌論文] RNA Editing of Serotonin 2C Receptor and Alcohol Intake (2020)
  • 著者名/発表者名: Tanaka M and Watanabe Y.
  • 雑誌名: Frontiers in Neuroscience 巻: 13 ページ: 1390
  • DOI: 10.3389/fnins.2019.01390
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hepatocyte growth factor regulates HIF-1α-induced nucleus pulposus cell proliferation through MAPK-, PI3K/Akt-, and STAT3-mediated signaling (2020)
  • 著者名/発表者名: Itsuji T、Tonomura H、Ishibashi H、Mikami Y、Nagae M、Takatori R、Tanida T、Matsuda KI、Tanaka M、Kubo T
  • 雑誌名: Journal of Orthopaedic Research 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1002/jor.24679
  • 査読あり
• [雑誌論文] Status of growth plates can be monitored by MRI. (2020)
  • 著者名/発表者名: Wada H, Ikoma K, Oka Y, Nishida A, Onishi O, Kim WC, Tanida T, Yamada S, Matsuda KI, Tanaka M, and Kubo T
  • 雑誌名: Journal of Magnetic Resonance Imaging 巻: 51 ページ: 133-143
  • DOI: 10.1002/jmri.26771
  • 査読あり
• [雑誌論文] α-Synuclein BAC transgenic mice exhibit RBD-like behaviour and hyposmia: a prodromal Parkinson’s disease model (2019)
  • 著者名/発表者名: Taguchi T, Ikuno M, Hondo M, Parajuli LK, Taguchi K, Ueda J, Sawamura M, Okuda S, Hara J, Uemura N, Hatanaka Y, Ayaki T, Matsuzawa S, Tanaka M, El-Agnaf OMA, Koike M, Yanagisawa M, Uemura M, Yamakado H, Takahashi R
  • 雑誌名: Brain 巻: 143 ページ: 249～265
  • DOI: 10.1093/brain/awz380
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] GBA haploinsufficiency accelerates alpha synuclein pathology with altered lipid metabolism in a prodromal model of Parkinson's disease. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ikuno M, Yamakado H, Akiyama H, Parajuli LK, Taguchi K, Hara J, Uemura N, Hatanaka Y, Higaki K, Ohno K, Tanaka M, Koike M, Hirabayashi Y, Takahashi R
  • 雑誌名: Human Molecular Genetics 巻: 28 ページ: 1894-1904
  • DOI: 10.1093/hmg/ddz030
  • 査読あり
• [学会発表] 側坐核ニューロペプチド入出力についての解剖学的解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山田俊児, Nienke van Kooten, 森琢磨, 田口勝敏, 辻村敦, 田中雅樹
  • 学会等名: 第１２５回日本解剖学会総会・全国学術集会
• [学会発表] Anatomical analysis of neuropeptide Y(NPY) neurons in the nucleus accumbens using NPY-Cre mice. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamada S, Nienke V K, Taguchi K, Mori T, Tsujimura A, Tanaka M
  • 学会等名: 第４２回日本神経科学大会・第62回日本神経化学会大会.
• [学会発表] 側坐核に存在するニューロペプチドY発現細胞が不安行動に及ぼす影響とその解剖学的解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山田俊児, 呉胤美, Nienke van Kooten, Mohammad Shyful Isulum, 田口勝敏, 森琢磨, 辻村敦, 渡邊義久, 田中雅樹 :
  • 学会等名: 第１５回GPCR研究会
• [学会発表] Anatomical analysis of neuropeptide Y neurons in the nucleus accumbens (2019)
  • 著者名/発表者名: Van Kooten Nienke, Shunji Yamada, Takuma Mori, Atsushi Tsujimura, Masaki Tanaka
  • 学会等名: 第124回日本解剖学会総会・全国学術集会.
• [学会発表] 脳虚血モデルを用いた嗅球傍糸球体細胞に高発現するパーキンソン病関連分子α-シヌクレインの機能解析. (2019)
  • 著者名/発表者名: 田口勝敏, 渡邊義久, 辻村敦, 田中雅樹
  • 学会等名: 第６０回日本組織細胞化学会総会・学術集会および第１３回日中合同組織細胞化学セミナー合同大会.
• [学会発表] Ethanol drinking behavior is regulated by RNA editing in the nucleus accumbens. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tanaka M, Shirahase T, Watanabe Y
  • 学会等名: 6th Congress of ASCNP(Asian college of neuropsychopharmacology).
  • 国際学会 / 招待講演
• [図書] Roles of Stress Response in Autophagy Processes. A chapter of book "Heat Shock Factors" (2020)
  • 著者名/発表者名: Watanabe Y, Taguchi K, Islam MS, Tsujimura A and Tanaka M
  • 総ページ数: -
  • 出版者: Springer-Nature
• [備考] 研究室ホームページ（京都府立医科大学 解剖学教室 生体構造科学部門）
  • URL: http://www.f.kpu-m.ac.jp/k/anatomy1/
• [備考] 大学ホームページ上の教室研究紹介
  • URL: https://www.kpu-m.ac.jp/doc/classes/igaku/seitai/35.html