| 研究課題/領域番号 |
17H03555
|
|---|
| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
|---|
研究代表者 |
内原 俊記 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 特任教授 (10223570)
|
|---|
| 研究分担者 |
吉田 眞理 愛知医科大学, 付置研究所, 教授 (60288545)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 4リピートタウ / 脱アミド化 / アルツハイマー病 / 進行性核上性麻痺 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究の当面目標は、疾患により異なるタウ沈着病態を反映する D279-4Rタウを髄液中で定量するELISA系を確立し臨床応用することである。すでにポリクローナル抗体でこのＤ279エピトープ発現がADに豊富で、PSPに乏しいことを明らかにしたが、安定したELISA系の確立のために、新たにD279-4Rモノクローナル抗体を作成する。現在特許出願中の方法を用いれば、 D279への反応性は高いがN279への反応性は乏しいクローンを選定できる。並行して新たなD279ポリクローナル抗体も改めて作製し、このエピトープの特徴を複数の抗体で検証する。以上により4Rタウに対する抗体はi)N279特異的なRD4(市販品), ii)N279/D279両者に反応する４R(市販品), iii)D279特異的なD279-4R(モノクローナルおよび、ポリクローナル抗体一部作成済)が得られることを最初の目標とする。ADと PSP・CBD脳をD279-4R抗体(モノクローナルおよびポリクローナル)を用いて比較する。ADとPSP/CBD例の異なる部位D279-4R陽性の病変を網羅的に検索する。これまでの検討ではD279-4R抗体はAD病変を陽性に染するが、PSP例のタウ病変を陽性に染色しないことを2019年に論文発表した。 検索の範囲を基底核や脳幹へ拡大しCBD例も加えて例数を増やし、包括的な検索を進める。並行して、 剖検脳を用いた Western blotを行い D279-4R抗体の特異性を生化学的にも確認し、ポリクローナル、モノクローナル抗体で比較する。その上で、D279-4R特異的なELISAを構築し、髄液診断の精度を高めることが第一の目的となる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ポリクローナル抗体の作成：D279を含む4Rタウ特異的ペプチドを用いて、3羽の家兎で抗体作成し高力価のポリクローナル抗体を得た。いずれも市販抗体と同様にN279/D279に反応するが、現在特許出願中の方法を用いてD279への親和性が高いが、N279への親和性に乏しい分画が同様に得られることを確認した。アルツハイマー病とPSP脳の比較：ADに特徴的な海馬NFTはD279陽性だが、PSPにみられる橋核のNFTはD279陰性でD279の親和性により疾患の背景が区別できることを確認した。複数のAD, PSP剖検脳を分担研究者より入手し,Western blotなどの生化学的検討を加えている。
モノクローナル抗体の作成: D279に親和性の高いマウスハイブリドーマ樹立を試みたが成功しなかった。そこでD279抗原で免疫した家兎脾臓よりヒトIgGvariable regionのみのcDNA libraryを作成し、大腸菌に発現させてD279抗体に反応する105クローンを樹立したが、力価が不十分であった。そこで同様に免疫した家兎脾臓のB細胞からD279-4Rエピトープに対する抗体を発現しているものをsortingし、その遺伝子からIgGを再構成する方法で家兎モノクローナル抗体を作製中である。
特許出願：特願2017－098795「4リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法」【発明者 内原俊記 100%】の審査請求を2020年5月に行った。
|
| 今後の研究の推進方策 |
家兎モノクローナル抗体クローンの選別：免疫した家兎脾臓のB細胞からD279-4Rエピトープに対する抗体を発現しているものをsortingし、その遺伝子からIgGを再構成する方法でいくつかのクローンを複数選別し、遺伝子配列を読みだした。その遺伝子を発現させた抗体の活性を確認したのち、発現系のスケールを拡大してADとPSPヒト剖検脳のdot blot, Western blot, 免疫組織化学で検証し、家兎ポリクローナル抗体より得たD279特異的分画と比較する。
髄液ELISAへの応用：上記により得られるD279特異的IgG variable regionの感度特異度を検討し、髄液診断へ現実的に応用可能かを検討する。Monoclonal IgGを用いた髄液ELISAの確立が最も望ましいが、既に実績のある家兎ポリクローナルIgGのD279特異的分画を用いたELISA系の確立を並行してめざす。両者の比較を行い臨床的応用可能性を検討した後実際にAD, PSP, 正常者の髄液中のタウを検討する。既存の髄液タウ診断キットを用いて同様の検討を行い、D279に注目した我々の髄液ELISA系での診断特性と比較する。
画像診断や治療法への発展：AD特異的な4Rタウ抗体は他に報告がないが、特異度、感度の高いモノクローナル抗体が得られれば、ヒト脳タウ沈着の分布のトレーサーや、タウ免疫治療の主働役として発展させられる可能性がある。
特許権の確立と拡大：現在特許出願段階の本発明を国内特許として実体化する。本発明の市場化を念頭に、秘密保持契約を締結し国内企業との相談を開始している。今後モノクローナル抗体が得られれば、海外特許出願も念頭に関連手続きを進める
|
