研究課題
慢性骨髄性白血病(CML)患者の生命予後はチロシンキナーゼ阻害剤 (TKI) の開発によって飛躍的に改善されたが，TKI治療後の再発が臨床上の重大な問題となっている．近年，このようなCMLの再発の原因となる細胞として大量のCML細胞を生み出すもとになるCML幹細胞が注目されている．このCML幹細胞の未分化性の制御にはWnt/beta-cateninシグナルが重要な役割を担うことが報告されているが，その活性を制御するメカニズムは明らかでない.研究代表者は，RNAシークエンスによりCML幹細胞において高発現している遺伝子の探索を行い，Wnt/beta-cateninシグナルの活性制御に関わるLgr4が高発現していることを発見した．本研究では，CML幹細胞の未分化性やTKI抵抗性の制御における幹細胞制御分子Lgr4の役割の解明を目的とした研究を実施している.H29年度，Lgr4の発現を抑制するshRNAの導入によりCML幹細胞のin vitroでのコロニー形成能が低下することを見出した．H30年度，生体内でのCML幹細胞の制御におけるLgr4の役割を明らかにするため，Lgr4遺伝子の発現レベルが10%に低下しているLgr4遺伝子トラップマウスとテトラサイクリン制御型CMLモデルマウス(Scl-tTAマウス・tetO-BCRABL1マウス)との交配を行なって，Lgr4遺伝子トラップCMLマウスモデルを樹立した．今後，Lgr4遺伝子トラップCMLマウスモデルを用いて，CML幹細胞の未分化性の維持，並びにTKI治療抵抗性におけるLgr4の役割を解析する．また，Lgr4を標的とすることでCML幹細胞を根絶する新規治療薬の開発を目指す．
2: おおむね順調に進展している
H30年度，熊本大学 荒木喜美博士よりLgr4遺伝子の発現レベルが10%に低下しているLgr4遺伝子トラップマウスの供与を受け，CMLマウスモデルの構築を試みた. 従来のLgr4遺伝子のノックアウトマウスは胎生期成長遅延や出生後致死となるため，in vivoでの機能解析が困難である．そこで, Lgr4遺伝子の発現レベルは低下しているが生存可能であるLgr4遺伝子トラップマウスを用い，テトラサイクリン制御型CMLモデルマウスとして知られているScl-tTAマウスとtetO-BCRABL1マウスとの交配を行なって，Lgr4遺伝子トラップCMLマウスを樹立した．テトラサイクリン制御型 CMLモデルマウスはテトラサイクリンの誘導体であるドキシサイクリン Dox の投与によってCMLの発症を抑え,投与を中止することでCML幹細胞の発生を誘導できるCMLマウスモデルである.今後，Lgr4遺伝子トラップCMLマウスモデルを用いて，in vivoでのCML幹細胞の制御におけるLgr4の役割を解析する計画である.一方，Wnt-beta-catenin経路を阻害することでCML幹細胞を抑制する化合物のin vitroでの探索を実施した．CMLマウスモデルより骨髄単核細胞を分離し，マウスCML幹細胞をソーティングした．このCML幹細胞を，生体内環境を模倣した低酸素環境下メチルセルロース培地中で培養して，Wnt-beta-catenin経路を阻害する化合物の処理を行なった．その結果，LGK974がCML幹細胞のコロニー形成能を抑制できることを見出した(LGK974は，Wnt3aのSer209のパルミトイル化により活性化を行なうPorcupinを阻害することが知られている化合物である).
1) Lgr4遺伝子トラップCMLモデルマウスを用いたCML幹細胞の機能解析上記のLgr4遺伝子トラップCMLマウスへのDox投与を中止し，CMLの発症誘導の有無，並びに生存期間を解析する．これらのマウスよりCML幹細胞を純化し，放射線照射を行なったレシピエントマウスに移植を行なって，生体内でのCML幹細胞の自己複製能の維持におけるLgr4の機能を解析する. また，Lgr4遺伝子トラップCMLマウスにイマチニブの投与を行なった後，残存するTKI抵抗性CML幹細胞の解析を行う.2) Lgr4遺伝子トラップCML幹細胞の遺伝子発現解析Lgr4遺伝子トラップCML幹細胞における遺伝子発現をRNAシークエンスにより解析し，Lgr4の下流の標的遺伝子を解明する．次いで，Lgr4標的遺伝子を標的とするshRNAの導入を行い,CML幹細胞の維持における標的遺伝子の機能を明らかにする.3) In vitro，並びにin vivoでのLgr4を標的とするCML幹細胞の治療薬の候補化合物の探索マウスCML幹細胞に対して，Lgr4遺伝子トラップCMLマウスモデルで抑制の見られたシグナルを標的とする阻害剤の処理を行なって，in vitroでのCML幹細胞の治療薬の候補化合物の探索を行なう．また，この候補化合物，並びにH30年度見出したCML幹細胞を抑制するLGK974をCMLマウスモデルに対して投与し，in vivoでのCML幹細胞への抑制効果を検証する．さらに，CMLマウスモデルに対してこれらの化合物とImatinibの併用投与を行ない，TKI抵抗性CML幹細胞に対する治療効果を明らかにする．
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巻: epub ahead of print ページ: epub
10.1038/s41375-018-0321-8.
