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2017 年度 実績報告書

Wntシグナル最下流の転写複合体における制御分子及び新規大腸がん治療標的の同定

研究課題

研究課題/領域番号 17H03603
研究機関国立研究開発法人国立がん研究センター

研究代表者

増田 万里  国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員 (70435717)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード大腸がん / Wnt シグナル / TCF4/β-catenin 転写複合体 / がん幹細胞 / 分子標的治療薬
研究実績の概要

がんの治療抵抗性の獲得に、「がん幹細胞(cancer stem cell)」の関与が考えられている。がん幹細胞は薬剤排出能、自己複製能、及び高い造腫瘍性を持つため、治療後に少数でも残存すると腫瘍を再構築し、再発の原因となると考えられている。よって、がん幹細胞を標的とする新規治療薬の開発が期待されている。大腸がんの90%以上にAPC遺伝子等のWntシグナル経路の遺伝子に変異があるため、同経路が恒常的に活性化し、がん幹細胞の発生に繋がると考えられている。我々はAPC の下流でWnt シグナルの実行因子として働くTCF4/β-catenin 転写複合体に着目し、転写因子TCF4 とタンパク質間相互作用する分子としてTNIK キナーゼを同定し、既にTNIK阻害薬NCB-0846を開発している。更に、免疫沈降法と質量分析を用いたプロテオーム解析から、大腸がん細胞におけるTCF4/β-catenin 転写複合体の分子はTNIK 以外にも存在する(70 個の候補分子)ことを明ら
かにしている。TCF4/β-catenin 転写複合体の制御の全貌を解明することは、Wnt シグナルに強く依存する発がんやがん幹細胞の維持に関わる分子機構の解明及び、有効な大腸がんの治療標的の同定に繋がると考え本研究の着想に至った。本研究課題では、1)TCF4/β-catenin 転写複合体においてTCF4 と相互作用し転写活性及びWnt シグナルを制御
する分子を同定し大腸がん治療標的を見出し、2)大腸がん治療標的としての妥当性・安全性について検討評価を行う。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初年度は、TCF4/β-catenin 転写複合体に含まれる70 個の候補分子のsiRNA ライブラリーを用いてWnt シグナル抑制タンパクの探索を行い、得られた候補分子について相互作用の検証を行うことを目標としていた。1次スクリーニングとしては、Wnt標的遺伝子であるMYC及びAXINの発現定量を行った。更に2次スクリーニングとし、3次元培養下でWnt シグナルの活性をGreen Fluorescence Protein (GFP)の蛍光強度で定量化できる独自に開発したWASA (Wnt signaling Activity in Spheroid Assay)法を用いてスクリーニング行いデータを取得した。。これらにスクリーニングによりWnt シグナル抑制効果を持つタンパク候補が複数検出され、現在、免疫沈降ウエスタン法によりTCF4との相互作用の確認を検討している。よって、ほぼ当初の計画通り、順調に研究は進行している。しかしながら、ポジティブコントロールのβ-cateninのsiRNAに匹敵する抑制効果を持つ分子は見つかっていない。

今後の研究の推進方策

平成30年度は、70 個の候補分子より複数同定されたWnt シグナル抑制タンパクについて、TCF4との相互作用を免疫沈降ウエスタン法及び共焦点顕微鏡によって確認し、薬剤標的となる分子の選択を行う。標的分子候補がある程度絞られた段階で、siRNA或いはshRNAを用いて候補分子をノックダウンした大腸がん細胞においてWntターゲット遺伝子の発現抑制を確認するとともに、細胞増殖抑制効果の検討も行う。次に、がん幹細胞性への影響を検討する。具体的には、大腸がん幹細胞の細胞表面マーカーであるCD133やCD44の発現への影響や、アセトアルデヒド脱水素酵素活性(ALDH)活性及び薬剤排出能の指標となるサイドポピュレーションをフローサイトメトリーを用いて調べ、限界希釈法によるスフェア形成能の検討を行う。その結果、がん幹細胞抑制効果が認められた分子について、マウスにおける造腫瘍能への影響を確認し、標的としての妥当性を判断する。治療標的としての妥当性が検証された分子について、ノックアウトマウスの作製を開始する。

  • 研究成果

    (17件)

すべて 2017 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 3件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 8件、 招待講演 3件) 図書 (1件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Signaling pathway profiling using reverse-phase protein array and its clinical applications2017

    • 著者名/発表者名
      Masuda Mari、Yamada Tesshi
    • 雑誌名

      Expert Review of Proteomics

      巻: 14 ページ: 607~615

    • DOI

      10.1080/14789450.2017.1344101

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] The emergence of TNIK as a therapeutic target for colorectal cancer2017

    • 著者名/発表者名
      Masuda Mari、Yamada Tesshi
    • 雑誌名

      Expert Opinion on Therapeutic Targets

      巻: 21 ページ: 353~355

    • DOI

      10.1080/14728222.2017.1297799

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Emergence of TNIK inhibitors in cancer therapeutics2017

    • 著者名/発表者名
      Yamada Tesshi、Masuda Mari
    • 雑誌名

      Cancer Science

      巻: 108 ページ: 818~823

    • DOI

      10.1111/cas.13203

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] Application of Proteomic Technology in Development of Novel TNIK Inhibitor Blocking Wnt Signaling2017

    • 著者名/発表者名
      Mari Masuda, Yuko Uno, Shigeki Kashimoto, Hideki Moriyama, Masaaki Sawa and Tesshi Yamada
    • 学会等名
      日本プロテオーム学会2017年大会JHUPO第15回大会
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Preclinical development of NCB-0846, a novel TNIK inhibitor that blocks Wnt signaling in colorectal cancer2017

    • 著者名/発表者名
      Mari Masuda, Takeomi Inoue, Yuko Uno, Hideki Moriyama, Shigeki Kashimoto, Naoko Goto, Masaki Sawa and Tesshi Yamada
    • 学会等名
      第76回日本癌学会学術総会
    • 国際学会
  • [学会発表] 新規TNIK 阻害薬によるEMT 制御2017

    • 著者名/発表者名
      菅野哲平、増田万里、宇野佑子、森山英樹、後藤尚子、清家正博、澤匡明、弦間昭彦、山田哲司
    • 学会等名
      第76回日本癌学会学術総会
    • 国際学会
  • [学会発表] TNIK は骨肉腫の新規治療標的となりうる2017

    • 著者名/発表者名
      弘實透、増田万里、後藤尚子、浅野尚文、小林英介、川井章、堀内圭輔、澤匡明、山田哲司
    • 学会等名
      第76回日本癌学会月術総会
    • 国際学会
  • [学会発表] TNIK 阻害剤はWnt シグナルを減弱させてがん幹細胞画分を減少させる2017

    • 著者名/発表者名
      宇野佑子、増田万里、森山英樹、澤匡明、山田哲司
    • 学会等名
      第76回日本癌学会学術総会
    • 国際学会
  • [学会発表] TRAF2 and NCK-interacting protein kinase(TNIK)は骨肉腫の分子標的となりうる2017

    • 著者名/発表者名
      弘實透,増田万里,浅野尚文,小林英介,川井章,堀内圭輔,松本守雄,澤匡明,森岡秀夫,中村雅也,山田哲司
    • 学会等名
      日本整形外科学会基礎学術集会
  • [学会発表] 骨肉腫治療におけるTNIK阻害剤の可能性2017

    • 著者名/発表者名
      弘實 透,増田万里,後藤尚子,菅野哲平,浅野尚文,小林英介,川井 章,堀内圭輔,松本守雄,中村雅也,澤 匡明,森岡秀夫,山田 哲司
    • 学会等名
      分子腫瘍マーカー研究会
  • [学会発表] A novel TNIK inhibitor potently downregulates cancer stem cell population through attenuation of Wnt signaling2017

    • 著者名/発表者名
      Yuko Uno, Hideki Moriyama, Shigeki Kashimoto, Mari Masuda, Masaaki Sawa, Tesshi Yamada
    • 学会等名
      AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics
    • 国際学会
  • [学会発表] Elucidation of Signaling Pathways Affected by TNIK Inhibitor, NCB-0846, Using Reverse-Phase Protein Array2017

    • 著者名/発表者名
      Mari Masuda, Takeomi Inoue, Yuko Uno, Masaaki Sawa and Tesshi Yamada
    • 学会等名
      RPPA Global Workshop 2017 Dublin
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] がん高精度医療における逆相タンパクアレイ基盤の有用性2017

    • 著者名/発表者名
      増田万里
    • 学会等名
      北里疾患プロテオーム研究会
    • 招待講演
  • [学会発表] Therapeutic target discovery by cancer proteomics in the era of large-scale genome-resequencing2017

    • 著者名/発表者名
      Tesshi Yamada and Mari Masuda
    • 学会等名
      HUPO 2017
    • 国際学会
  • [図書] 大腸がんの幹細胞増殖を抑える新規化合物発見から創薬へ2017

    • 著者名/発表者名
      増田万里
    • 総ページ数
      1
    • 出版者
      日経サイエンス
  • [備考] 国立がん研究センター研究所・連携研究室(増田グループ)

    • URL

      https://www.ncc.go.jp/jp/ri/division/genetics/project/index.html

  • [備考] 個別医療に有用なバイオマーカーの開発

    • URL

      https://www.ncc.go.jp/jp/ri/department/clinical_proteomics/project/030/index.html

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公開日: 2021-01-27  

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