研究課題
がんの治療抵抗性の獲得に、「がん幹細胞(cancer stem cell)」の関与が考えられている。がん幹細胞は薬剤排出能、自己複製能、及び高い造腫瘍性を持つため、治療後に少数でも残存すると腫瘍を再構築し、再発の原因となると考えられている。よって、がん幹細胞を標的とする新規治療薬の開発が期待されている。大腸がんの90％以上にAPC遺伝子等のWntシグナル経路の遺伝子に変異があるため、同経路が恒常的に活性化し、がん幹細胞の発生に繋がると考えられている。我々はAPC の下流でWnt シグナルの実行因子として働くTCF4/β-catenin 転写複合体に着目し、転写因子TCF4 とタンパク質間相互作用する分子としてTNIK キナーゼを同定し、既にTNIK阻害薬NCB-0846を開発している。更に、免疫沈降法と質量分析を用いたプロテオーム解析から、大腸がん細胞におけるTCF4/β-catenin 転写複合体の分子はTNIK 以外にも存在する（70 個の候補分子）ことを明らかにしている。TCF4/β-catenin 転写複合体の制御の全貌を解明することは、Wnt シグナルに強く依存する発がんやがん幹細胞の維持に関わる分子機構の解明及び、有効な大腸がんの治療標的の同定に繋がると考え本研究の着想に至った。本研究課題では、１）TCF4/β-catenin 転写複合体においてTCF4 と相互作用し転写活性及びWnt シグナルを制御する分子を同定し大腸がん治療標的を見出し、２）大腸がん治療標的としての妥当性・安全性について検討評価を行う
3: やや遅れている
TCF4/β-catenin 転写複合体に含まれる70 個の候補分子のsiRNA ライブラリーを用いて、１）Wnt標的遺伝子であるMYC及びAXINの発現定量によるスクリーニング、次に２）3次元培養下でWnt シグナルの活性をGreen Fluorescence Protein (GFP)の蛍光強度で定量化できる独自に開発したWASA (Wnt signaling Activity in Spheroid Assay)法によるスクリーニング行い、Wnt シグナル抑制効果を持つタンパク候補が複数検出（NXF-1, RAN, TOP2A等）した。しかしながら、これらの中にポジティブコントロールであるβ-cateninのsiRNAに匹敵する抑制効果を持つ分子は見出されなかった。本研究２年目はそれらの複数の候補分子について、細胞増殖抑制効果及びwnt標的遺伝子発現抑制効果のスクリーニングを行い、更に候補分子の絞り込みを行った。興味深いことに、候補分子にはDNA損傷修復、とりわけDNA二重鎖切断のDNA修復機序に関わる分子が複数含まれていた。よって、TCF4/β-catenin 転写複合体によるWnt標的遺伝子の転写にはDNA修復機序が重要な役割を果たしていることが推測された。現在、TCF４抗体を用いた免疫沈降ウエスタン法により、DNA損傷修復に関わる分子を中心にTCF4との相互作用を検証し、更に共焦点顕微鏡によりTCF4/β-cateninの共局在を確認している。本研究課題最終年度である2019年度は、候補分子同士の相互作用も検討し、TCF4/β-catenin 転写複合体の機能・全体像への関与や役割を明らかにすると同時に、候補分子の治療標的分子としての妥当性をin vitroで検証を行う予定である
当初、β-cateninのsiRNAに匹敵するwntシグナル抑制効果を持つ分子は見出されることを期待し開始したスクリーニングであったが、単独でβ-cateninのsiRNAに匹敵する抑制効果を持つ分子は見出すことはできなかった。しかしながら、更に細胞増殖抑止効果および、Wnt標的遺伝子(c-myc及びAxin2)の発現抑制効果によるsiRNAを用いたスクリーニングを行った結果、比較的強い抑制効果を持つ複数の遺伝子はいずれも、DNA損傷修復に関わる遺伝子であることを見出した。本スクリーニングによって、単純に治療標的となる分子の同定には至らなかったが、DNA損傷修復に関わる遺伝子がTCF4/β-catenin 転写複合体の制御に深くかかわる可能性が今回の解析により示唆された。その全貌を解明することは、Wnt シグナルに依存する発がんやがん幹細胞の維持に関わる分子機構の解明及び、有効な大腸がんの治療標的の同定に繋がることが期待できる。若干、回り道となったが、本年はDNA損傷修復に関わる遺伝子が互いにどのように相互作用し、またそれらのうちどの遺伝子が欠損することで、TCF4/β-catenin 転写複合体の機能がどのように変化するか詳細を明らかにし、治療標的としての可能性を検討する予定である。
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HepatoBiliary Surg Nutr.
巻: 1 ページ: 74-76
10.21037/hbsn.2018.10.10
