| 研究課題/領域番号 |
17H03604
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
中川 真一 北海道大学, 薬学研究院, 教授 (50324679)
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| 研究分担者 |
横井 佐織 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (10772048)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ノンコーディングRNA / 4.5SH / ES細胞 / 未分化状態 |
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| 研究実績の概要 |
メダカの脳でタンパク質と強固な複合体を形成している新規ノンコーディングRNAの解析を進める過程で、公共データベースのリボソームプロファイルングのデータを再解析したところ、特に集中して研究を進めていた２つの遺伝子は、実はタンパク質をコードする遺伝子の一部であることが明らかとなった。そこで、現在までに見られていた行動異常の表現型がタンパク質産物によるものか、mRNAが機能性RNAとして機能しているのかを区別するために、ゲノム編集法を用いてストップコドンを挿入した個体を作製した。また、タンパク質の局在を検出するために、タグ配列をノックインした個体を作製した。
また、昨年度までの研究で、マウス目特異的なノンコーディングRNA、4.5SHのノックアウトマウスが着床直後に耐性致死となることが明らかとなっていた。4.5SHノックアウト胚で見られる遺伝子発現異常を解析するために、昨年度に作製した4.5SHノックアウトマウス由来のES細胞を用いてRNA-Seq解析を行った。その結果、多能性の維持に関わる複数の遺伝子に発現異常が見られることが明らかとなった。また、レトロトランスポゾンのSINE B1の発現が増加する傾向にあることが明らかとなった。さらに、リボソーム遺伝子の5'ETS領域の発現が著しく上昇するほか、リピート配列を用いた蛍光in situハイブリダイゼーションを行ったところ、核小体近辺に野生型では見られない新規の構造体が出現することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
4.5SHのノックアウトマウス由来のES細胞を用いてRNA-Seq解析や細胞生物学的な解析を行った結果、これまで報告されていたmRNAの細胞内局在の制御以外に、レトロトランスポゾンの発現制御や核内構造体の制御など、全く新たな分子経路にこのノンコーディングRNAが関わっていることが示唆された。4.5SHの分子機能の研究は世界で全く報告がなく、今後、新規の核内制御機構が明らかになることが期待される。これらの観察結果は研究計画を立てた時点では全く想定されていなかったものであり、当初の計画以上の研究の進展が見られている。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度は予想外の結果が得られつつあるマウス目特異的な4.5SHの機能解析を集中して行う。
4.5SHノックアウトマウスではタンデムに存在する900MBにもわたる4.5SHクラスターを欠失させている。そこで、4.5SHノックアウトマウスで見られる影響がこの領域から転写される4.5SH RNAの欠失によるものなのか、このような大きなゲノム領域が欠損した影響によるものかを区別するために、4.5SHをRNAポリメラーゼIIIのプロモータの下流で強制発現するレンチウイルスを作製し、レスキュー実験を試みる。この際、4.5SHノックアウトマウス由来のESでは細胞増殖の低下のほか各種マーカー遺伝子の発現変化が見られているので、それらの表現型が回復するかどうかを指標とする。また、核小体付近に新規の核内構造の形成が見られているので、この構造体がperinucleola compartmentやnucleolus amyloid bodyなどの構造体と一致するかどうかを、二重染色によって検証する。さらに、これらの表現型に至る分子機構を明らかにするために、ビオチンラベルした4.5SHを合成し、pull down実験を行って4.5SHが形成しているタンパク質-RNA複合体の同定を試みる。複合体の構成因子が同定できたらそれらを欠損するES細胞をゲノム編集によって作製し、4.5SHのノックアウトマウスで見られたような表現型が見られるかどうかも明らかにしてゆく。
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