| 研究課題/領域番号 |
17H03613
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
畑田 出穂 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (50212147)
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| 研究分担者 |
堀居 拓郎 群馬大学, 生体調節研究所, 准教授 (00361387)
森田 純代 群馬大学, 生体調節研究所, 研究員 (40589264)
澁谷 海大 群馬大学, 生体調節研究所, 研究員 (70786839) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
制御性T細胞の機能異常や不足は、自己免疫疾患や炎症性疾患の原因となる。そのためその補充や増強はこれらの疾患の重要な治療戦略である。制御性T細胞はナイーブCD4陽性T細胞（ナイーブT細胞）からTGFベータにより誘導できるが、発現が一過的である。それは制御性T細胞マスター遺伝子FoxP3がメチル化されているからである。申請者らはこれまでに、ゲノム編集技術を応用して特定遺伝子のみのエピゲノム（DNAメチル化)を操作する手法を開発してきた(Nature Biotech., 2016)。そこで本研究では我々が開発したエピゲノム編集技術を用いて制御性T細胞マスター遺伝子FOXP3のメチル化を消去することにより安定な制御性T細胞を作製し、自己免疫疾患の新たな治療戦略を提唱する。これまで脱メチル化法として知られていたのはDNAメチル基転移酵素の阻害剤であるアザシチジンであるが、これによる脱メチル化は非特異的に標的以外の遺伝子を脱メチル化することから安全性に問題があった。そこで我々は特定の遺伝子をゲノム編集技術を利用し、脱メチル化するエピゲノム編集技術の開発をおこなってきた。我々は遺伝子切断活性をなくした Cas9（dCas9）と、DNA の脱メチル化の最初の反応を起こす酵素（TET）を直結し、TETの活性を標的にリクルートしたが、十分に発現を活性化できなかった。そこで、脱メチル化能力を向上させるため、（１）dCas9 の端に短い目印のアミノ酸配列(GCN4)を複数個つないだものと（２）GCN4を認識して結合するミニ抗体にTET をつなげたものを同時に細胞に導入して新規複合体を構成させる方法を開発した。それにより特定の遺伝子に複数の TET が作用し、効率的に脱メチル化し遺伝子発現を十分に上昇させることができた。一方、標的の遺伝子以外ではまったく脱メチル化が見られず特異性が高いことがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
制御性T細胞（Treg 細胞）の機能異常や不足は、自己免疫疾患や炎症性疾患の原因となる。そのためその補充や増強はこれらの疾患の重要な治療戦略である。本研究では我々の開発したCRISPR/Cas9ゲノム編集とエピトープとミニ抗体を利用した標的特異的な脱メチル化編集法を用いて制御性T細胞（Treg 細胞）のマスター遺伝子FoxP3を特異的に脱メチル化するシステムを構築し、ナイーブCD4陽性T細胞から安定した制御性T細胞(Treg)を作製する。そして作製した自己免疫疾患モデルであるFoxP3ノックアウトマウスにこの細胞を投与することにより、その有効性と安定性を検証する。これにより安定したTregによる自戦略自己免疫疾患の新たな治療戦略を可能とする。本年度は、脱メチル化編集法を改良するとともに、バキュロウイルスにクローニングし、リコンビナントタンパク質を発現し、精製した。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度はリコンビナントタンパク質を用い、T細胞への導入のためのエレクトロポーレーション、リポソームなどデリバリーシステムを検討する。またウイルスベクターによる導入も検討する。
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