動物個体における転写と共役したmRNAプロセシングの制御機構の解明

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H03633
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 黒柳 秀人 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (30323702)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 遺伝子発現 / 新生RNA / 線虫 / 組織特異性 / 転写後プロセシング / mRNA / RNAseq / 代謝標識

研究実績の概要

1．本研究課題は、線虫をモデルとしてmRNA前駆体のプロセシングが転写伸長と共役して進行していく過程を個体レベルでゲノムワイドに明らかにすることを目指している。そのために、計画Aとして、転写伸長途中の新生mRNA前駆体の精製を計画していたが、核run-on法で新生RNAを標識してから全RNAを精製しさらに標識RNAを精製する方法を確立した。計画B1として、精製した新生RNAの全長シーケンス解析を計画していたが、調製した新生RNA画分に対してまずポリA(+) RNAとリボソームRNAの除去を行い、3’末端にアダプターを付加してから逆転写を行ってライブラリを調製する方法を確立した。さらに、新学術領域研究「先進ゲノム支援」の支援を受けて全長RNAシーケンス解析を依頼し、現在は結果を待つ段階にある。計画B2として新生RNAのRNAseq解析を計画していたが、こちらも「先進ゲノム支援」の支援を受けて大規模シーケンス解析を行った。RNAseq解析については、計画Cのデータ解析で5’末端形成、3’末端形成とスプライシングの順序関係を予測し、計画Dとして、いくつかの遺伝子について転写と共役したスプライシングや5’末端形成、3’末端形成とスプライシングとの順序関係についてRT-PCRによる実験的な検証を行い、得られたデータからプロセシングの順序をある程度予測できていることを確認した。計画FのLST-3が結合するクロマチン領域の解析については、「先進ゲノム支援」の支援を受けてChIPseq解析を行い、データを得た。
２．線虫のトロポミオシンをコードするlev-11遺伝子のスプライスバリアントを詳細に解析し、エクソン7aを含む新たなアイソフォームとしてLEV-11Oを同定し、頭部体壁筋でのみ発現することを報告した。
３．線虫のmRNAプロセシング制御についての総説を発表した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

計画Aについては、予定どおり方法を確立して新生mRNA前駆体を大量調製することができた。計画Bについては、B1はライブラリ調製まで進みシーケンス解析を依頼するところまで年度内に終了したが、データを出していただくのを待っている段階にある。B2はRNAseqのライブラリを調製して依頼に出し、すでにデータの返却を受けてCのデータ解析を行っており、計画どおりである。DのRT-PCRによる検証も、RNAseqデータにより予測されたプロセシング順序については解析を試みて概ね期待された結果を得ており、順調に進んでいる。計画Eについては、LST-3タンパク質と共沈降するタンパク質の精製法に関して、架橋剤で固定しない抽出液では共沈するタンパク質がほとんど見られず、架橋してからの共沈降では逆に100以上の多種類のタンパク質が共沈してしまうため、特異的に結合する因子の同定には至っておらず、当初の計画より遅れている。計画FのLST-3のクロマチン免疫沈降、lst-3変異体のクロマチン免疫沈降は、すでにChIP-seqのデータを得ており、計画どおりと言える。

今後の研究の推進方策

基本的には、当初の研究計画に沿って、前年度のまでの成果を受けて引き続き研究を進めていく。
計画B1で前年度に依頼した全長RNAseqの結果が得られたら、計画Ｃのシーケンス解析データの生物情報学的解析を行い、各遺伝子の各イントロンについて、mRNA前駆体の3'末端＝Pol IIの転写位置とスプライシング完了率の関係の規則性を明らかにすることを目指す。そして、計画Ｄで、Cで推定した転写と共役したイントロン除去の順序が実際の線虫個体でのイントロン除去の順序と整合性があるかRT-PCRにより実験的に検証する。計画Ｅは、架橋剤で固定したクロマチンを出発材料にして、DNA/RNAの酵素的分解を組み合わせることでLST-3と共沈するタンパク質の種類を減らして特異性を上げることを目指す。計画Fは、前年度までのChIPseqのデータを解析してLST-3の結合領域を明らかにし、野生型とlst-3変異体でPol IIなど転写に関わる因子の局在にどのような影響があるかChIP-qPCRで解析して見当を付ける。計画Gでは、lst-3変異体の新生RNAを野生型と同様の方法で調製して、計画A, Bと同様の方法でシーケンス解析を行う。

研究成果

• [国際共同研究] Emory University(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Emory University
• [国際共同研究] University of California, Los Angeles(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of California, Los Angeles
• [国際共同研究] Indiana University School of Medicine(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Indiana University School of Medicine
• [雑誌論文] Tropomyosin isoforms differentially affect muscle contractility in the head and body regions of the nematode Caenorhabditis elegans (2018)
  • 著者名/発表者名: Barnes Dawn E.、Watabe Eichi、Ono Kanako、Kwak Euiyoung、Kuroyanagi Hidehito、Ono Shoichiro
  • 雑誌名: Molecular Biology of the Cell 巻: 29 ページ: 1075～1088
  • DOI: 10.1091/mbc.E17-03-0152
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Phosphorylation of the RSRSP stretch is critical for splicing regulation by RNA-Binding Motif Protein 20 (RBM20) through nuclear localization (2018)
  • 著者名/発表者名: Rie Murayama, Mariko Kimura-Asami, Marina Togo-Ohno, Yumiko Yamasaki-Kato, Taeko K. Naruse, Takeshi Yamamoto, Takeharu Hayashi, Tomohiko Ai, Katherine G. Spoonamore, Richard J. Kovacs, Matteo Vatta, Mai Iizuka, Masumi Saito, Shotaro Wani, Yuichi Hiraoka, Akinori Kimura and Hidehito Kuroyanagi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] An emerging model organism Caenorhabditis elegans for alternative pre-mRNA processing in vivo (2017)
  • 著者名/発表者名: Wani Shotaro、Kuroyanagi Hidehito
  • 雑誌名: Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA 巻: 8 ページ: e1428～e1428
  • DOI: 10.1002/wrna.1428
  • 査読あり
• [学会発表] C. elegans代謝関連遺伝子のスプライシング制御における食餌の影響 (2018)
  • 著者名/発表者名: 和仁翔太郎
  • 学会等名: 東京地区線虫勉強会
• [学会発表] Genome-Wide Kinetic Analysis of Pre-mRNA Processing in Living Animals (2018)
  • 著者名/発表者名: 渡部栄地
  • 学会等名: 東京地区線虫勉強会
• [学会発表] 個体レベルで行うmRNA前駆体プロセシングの動態の解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 渡部栄地、黒柳秀人
  • 学会等名: 第19回日本RNA学会年会
• [学会発表] C. elegans代謝関連遺伝子のスプライシング制御における食餌の影響 (2017)
  • 著者名/発表者名: 和仁翔太郎、黒柳秀人
  • 学会等名: 第19回日本RNA学会年会
• [学会発表] Genome-wide kinetic analysis of pre-mRNA processing in living animals (2017)
  • 著者名/発表者名: Eichi Watabe, Hidehito Kuroyanagi
  • 学会等名: CSHL Meeting on 40 YEARS OF mRNA SPLICING: FROM DISCOVERY TO THERAPEUTICS
• [学会発表] 個体レベルで行う mRNA前駆体プロセシングの動態の解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 渡部栄地、黒柳秀人
  • 学会等名: ConBio2017（2017年度生命科学系学会合同年次大会）
• [図書] 遺伝子発現制御機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 田村隆明、浦聖惠（編）
  • 総ページ数: 264
  • 出版者: 東京化学同人
  • ISBN: 9784807909179
• [備考] フロンティア研究室 遺伝子発現制御学
  • URL: http://www.tmd.ac.jp/end/
• [備考] 「ノンコーディングRNAネオタクソノミ」研究成果紹介
  • URL: https://ncrna.jp/blog/item/370-rouge
• [備考] みらいぶプラス
  • URL: https://www.milive-plus.net/newleader/049/