• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2019 年度 実績報告書

可溶型GalNAc転移酵素を用いたO-GlcNAc修飾タンパク質の網羅的機能解析

研究課題

研究課題/領域番号 17H03639
研究機関東京大学

研究代表者

山本 一夫  東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (20174782)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード糖鎖 / 翻訳後修飾 / 糖転移酵素
研究実績の概要

O-GlcNAc修飾ペプチドに対する特異的抗体を用いてO-GlcNAc修飾された転写因子Aと相互作用しているタンパク質をプルダウンによって探索・同定することを試みたが銀染色ではほとんど確認できなかった。そのため、プルダウンしたサンプルを直接質量分析によって同定を行ったところ複数のタンパク質が同定された。質量分析で特定できたタンパク質に関しては、相互作用の確認をすべくcDNAを取得し、FLAG-tag付加して細胞内で発現させ転写因子Aとの共沈降を行い一部検証した。
一方、相互作用するタンパク質を事前にビオチン化し、このタグを用いてタンパク質を精製・同定するという手法を検討した。ビオチンリガーゼ変異体BirA(R118G)にWJA-Fcを融合させたさまざまな組み合わせのタンパク質をCHO細胞に発現、プロテインAカラムによる精製後に活性と収量を比較検討し、WJA-BirA(R118G)-Fcをが最も良いことがわかった。これを細胞に振りかけ、ATPとビオチン存在下でWJAが結合するタンパク質およびその近傍のタンパク質をビオチン化し、二次元電気泳動で一つのスポットが染色された。上記の系をさらに普遍的に利用できるように、インテインを用いたプロテインライゲーションの実験系を検討した。BirA(R118G)をキチン結合ドメインの融合タンパク質として大腸菌で発現させDTTによりこのドメインを切断した。一方、Cys残基をN末端にもつタンパク質を作成し求核反応で融合させる手法である。タンパク質にCysを導入する手法は、まずTevプロテアーゼによる切断サイト(ENLYFQ/C)をN末に付加した組換体タンパク質を発現させる方法と、化学的に修飾を施す手法を行った。今後、O-GlcNAc修飾タンパク質と相互作用する分子の同定が容易に行うことができるようになり、機能に関する理解が進むと考えられる。

現在までの達成度 (段落)

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2019

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件) (うち招待講演 2件)

  • [雑誌論文] TGF-b signaling promotes tube-structure-forming growth in pancreatic duct adenocarcinoma2019

    • 著者名/発表者名
      Yamaguchi, T., Ikehara, S., Akimoto, Y., Nakanishi H., Kume, M., Yamamoto, K., Ohara, O., Ikehara, S., Ikehara, Y.
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 9 ページ: 11247

    • DOI

      https://doi.org/10.1038/s41598-019-47101-y

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] レクチン医学最前線-はじめにー2019

    • 著者名/発表者名
      山本一夫
    • 雑誌名

      医学のあゆみ

      巻: 269 ページ: 629

  • [雑誌論文] 改変レクチンの創出2019

    • 著者名/発表者名
      山本一夫
    • 雑誌名

      医学のあゆみ

      巻: 269 ページ: 720-726

  • [学会発表] 膵管腺癌の3次元培養下における表現型に関わるO-GlcNAc修飾の機能2019

    • 著者名/発表者名
      粂優彦、山口高志、池原譲、山本一夫
    • 学会等名
      第92回日本生化学会大会
    • 招待講演
  • [学会発表] 糖鎖機能を標的とした創薬デザイン2019

    • 著者名/発表者名
      山本一夫
    • 学会等名
      第36回プラズマ核融合学会年会
    • 招待講演

URL: 

公開日: 2021-01-27  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi