| 研究課題/領域番号 |
17H03642
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
三木 邦夫 京都大学, 理学研究科, 名誉教授 (10116105)
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| 研究分担者 |
藤橋 雅宏 京都大学, 理学研究科, 助教 (10397581)
渡部 聡 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (50432357)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 構造生物学 / Ｘ線結晶解析 / 成熟化タンパク質 / ヒドロゲナーゼ / 構造機能相関 |
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| 研究実績の概要 |
超好熱性アーキアT. kodakarensis由来のヒドロゲナーゼ成熟化タンパク質の構造・機能解析を行った．
ヒドロゲナーゼへのNi原子組み込み機構解明のため，Niの組み込みに関わるHypAとヒドロゲナーゼ大サブユニットHyhLとの複合体の結晶化，構造解析を行った．HypA-HyhL複合体の調製法はすでに確立されており，予備的な結晶も得られていた．2種の結晶は（空間群C222およびP23）4Å分解能を超える回折を示していたが，さらに高い分解能の結晶を得るため，試料調製および結晶化条件の最適化を行い，それぞれの結晶系で3.5Å分解能を超える回折を与える結晶を得た．放射光Ｘ線で測定した回折データに分子置換法を適用し， 3.3Å分解能でR値およそ30％にまで精密化を行った．HyhL-HypA複合体の結晶構造では対応する構造からのいくつかの変化が見られた．この複合体の構造から，[NiFe]ヒドロゲナーゼの成熟化過程において，活性部位へのNi挿入がHyhLのNおよびC末端の空間上の再配置を引き起こすことが示唆された．
ヒドロゲナーゼへのFe原子組み込み機構解明のため，Feの組み込みに関わるHypCとHyhLとの複合体の調製した．結晶が得られたがＸ線の回折は観察できなかった．
ヒドロゲナーゼ成熟化後の切断機構を解明するため，[NiFe]クラスターが組み込まれたHyhLの調製に取り組んだ．嫌気チェンバーを用いて菌体の大量培養を行ったが，HyhL（pre-HyhL）はほとんど検出できなかった．新たに，このアーキアに存在するもう一つの成熟化プロテアーゼHycI（主に膜結合性ヒドロゲナーゼ（大サブユニット）MbhLに作用するが，HyhLに対しても触媒作用がある）を構造解析した．HycIを結晶化して，放射光Ｘ線を用いて1.6Å分解能の回折データを測定し，R値20.6％まで精密化した
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒドロゲナーゼへのNi原子組み込み機構解明においては，HypA-HyhL複合体について，その複合体化が困難な対象であるにもかかわらず結晶が得られ，およそ3.3Å分解能での構造解析に成功した．今後，さらなる分解能の向上や複合体構造の詳細な検証を行うことが必要であるが，この構造決定はHypA-HyhL複合体での初めての成果であり，ヒドロゲナーゼへのNi原子組み込み機構の解明に大きく貢献するものと思われる．
ヒドロゲナーゼへのFe原子組み込み機構解明において，HypC-HyhL複合体の調製ならびに結晶化はまだ達成できていないが，当初から困難が予想された研究対象であり，今後も実験状況を適切に判断して今後の指針を検討することが必要である．
ヒドロゲナーゼ成熟化後の切断機構の解明については，[NiFe]クラスターが組み込まれたヒドロゲナーゼ大サブユニットHyhL（pre-HyhL）の調製を継続している．新たに，T. kodakarensisに存在するもう一つの成熟化プロテアーゼHycIの構造解析に成功した．HycIは主に膜結合性ヒドロゲナーゼ（大サブユニット）MbhLに作用するが，HyhLに対しても触媒作用があるためことが分かったため構造解析の対象とした．放射光Ｘ線を用いて1.6Å分解能の結晶構造が得られた．HycIの全体構造は，HyhLに作用する成熟化プロテアーゼHybDに類似しているが，基質を認識すると思われるクレフトに存在するループ構造が長くなっており，これが触媒作用の違いに関係する可能性があるという興味深い知見が得られた．
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| 今後の研究の推進方策 |
HyhL-HypA複合体について，これまでに得られている結晶構造から，HyhLとHypAの相互作用の詳細をさらに検討する．また，得られている他の複合体の結晶構造を参照して，HyhL，HypA，HypB間の相互作用や成熟化前後のHyhLの構造変化を検証する．それらによって，ヒドロゲナーゼへのNi原子組み込みによる成熟化機構を検討する．また，HyhL-HypA複合体結晶の分解能の向上を目指して，結晶化条件の検討をさらに継続して，より高い精度での複合体構造の決定を目指す．
HyhL-HypC複合体について，これまでに得られている結晶からはＸ線の回折像が得られなかったため，新たな発現系構築を含めた調製方法の検討，結晶化条件の再検討等を行い，良好なHyhL-HypC複合体結晶の作製を行う．
ヒドロゲナーゼ成熟化後の切断機構解明について，HyhL（pre-HyhL）の調製条件の検討を行う．HyhLの発現量の向上を目指して．高発現プロモーターを組み込んだT. kodakarensis菌体の作製を試みる．
さらに，これまでに蓄積されている成熟化タンパク質群の構造生物学的知見を総括して，金属原子取り込みならびにヒドロゲナーゼ成熟化の分子機構の全体像を明らかにする．
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