| 研究課題/領域番号 |
17H03644
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
山下 敦子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (10321738)
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| 研究分担者 |
日下部 裕子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, ユニット長 (90353937)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 味覚受容体 |
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| 研究実績の概要 |
味覚受容体T1r2/T1r3に対する各種イオンの作用解析を実施し、亜鉛を含む複数の重金属イオンが、さまざまな動物種由来のT1r2/T1r3の味物質応答を阻害することを確認した。一方、阻害を示さないイオンも存在し、阻害作用が金属種特異的である可能性が示唆された。
これらのイオンの結合部位を同定するため、結晶構造解析可能なメダカT1r2a/T1r3リガンド結合ドメイン(LBD)を用いて、阻害を示したイオン2種、示さなかったイオン2種、応答を引き起こす可能性があるイオン1種の結合状態のX線結晶構造解析を実施し、2.2~3.1 A分解能の回折強度データを得た。得られたデータから、LBDに存在する複数の金属イオン結合部位を同定した。
さらに、これらの結合部位のうち、応答阻害に関わる部位を同定するため、変異体の応答実験を実施した。その結果、受容体の細胞外領域で、LBDよりも下流に存在するシステインリッチドメイン(CRD)に阻害に関与する可能性を示唆する部位を見出した。
CRDも含むT1r2a/T1r3細胞外全領域(ECD)については、これまで得ていた発現量が低かったため、発現コンストラクトの改善を行った結果、精製タグ付加位置の変更により、大幅に発現量を向上させることができ、当該コンストラクトを用いて大量発現系を構築した。
ついで、T1r2a/3ECDの構造動態解析を目的に、一分子蛍光共鳴エネルギー移動解析を行うための試料調製を行ったが、期待される蛍光強度変化を示す試料を得ることができなかった。そこで、蛍光タンパク質を標識として用いる場合の予備解析として、蛍光タンパク質の構造解析および生化学解析を行った。さらに、一分子観察手段として、すでに共同研究で得ていた高速原子間力顕微鏡観察結果を利用することとし、共同研究により分子シミュレーション解析を実施するためのモデル準備を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本課題の目標の１つが、異なる機能状態、特に阻害状態の構造を捉えることであり、H29年度に重金属イオンが味覚受容体に対し阻害効果を示すこと、および低分解能でのメダカT1r2a/T1r3LBD結合結晶構造を得ていた。H30年度の目標として、種々の重金属イオンの阻害効果を確認し、構造解析においては高分解能構造情報を得てLBD結合部位を同定することを計画していたが、これらの研究項目において全て目標を達成した。さらに、同じくH30年度の研究項目としていた変異体解析による部位同定についても、目標を達成し、阻害標的部位候補を見出した。一方で、有望な候補部位として見出された部位が、LBDより下流のCRD領域に見出されたことから、細胞外全領域(ECD)についても構造機能解析を進める必要性があることが判明した。T1r2a/T1r3ECDについては、すでに発現系を構築していたものの、発現量の低さが解析の制限となっていたが、H30年度にコンストラクトを改善することによりこの問題を解決し、大量発現系を構築して、今後の解析準備を整えた。
本課題のもう１つの目標である構造動態解析については、当初予定していた一分子蛍光共鳴エネルギー移動解析のための試料調製が予定通り進まなかったものの、一分子観察結果としてH29年度までに得ていた高速原子間力顕微鏡観察結果を用いて以降の解析を進める計画に変更し、H30年度に共同研究として準備に着手した。
以上から、計画の多くの項目において順調に進展し、一部の項目で当初の予定通り進まなかったものの、計画の変更により目標の達成に向け準備を進めていることから、本課題はおむね順調に進捗していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
H30年度に引き続き、構造解析条件が確立できているメダカT1r2a/T1r3LBDについて、リガンド非結合状態や阻害剤結合状態を含めた各種条件下での構造解析を実施する。また、受容体応答を示す可能性があるイオンについて、H30年度に得られた結合体の結晶構造データの構造解析を進めるとともに、T1r2a/T1r3LBD試料を用いた各種結合解析を実施する。
加えて、H30年度までの解析で、T1rによる応答やその阻害を考える上で、T1r2a/T1r3ECDを取り扱う重要性が高まったため、H30年度に構築したT1r2a/T1r3ECD大量発現系を基盤に、発現・精製条件の最適化を行い、精製試料を用いた結晶化条件探索を行う。構造解析については、結晶構造解析に加え、得られた精製試料のクライオ電子顕微鏡解析も試行する。構造解析条件が確立できれば、すでに見出している阻害作用を示す重金属イオンも含め、受容体機能を制御する各種リガンド存在下での構造解析を実施する。さらに、T1rECDを用いて、蛍光タンパク質融合体などを用いた蛍光共鳴エネルギー移動解析系を構築し、味物質や阻害剤結合条件下での構造変化の解析を行う。加えて、引き続き全長受容体を用いた応答解析を実施し、変異体解析などを通して阻害部位をはじめとする受容体機能調節部位の同定を行う。
これらの解析で得られた結果と、H30年度より共同研究により実施しているMDシミュレーションの結果を統合し、T1r細胞外領域の構造変化がシグナル伝達を引き起こすメカニズムについて考察する。
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