研究課題
生体膜の脂質二重層は、その内葉と外葉において脂質組成の非対称性を有している。細胞膜においてホスファチジルセリンの細胞外への暴露は重大な事象であり、従来アポトーシスや血小板凝集など非常時にのみ起こるものと考えられてきた。本研究では、このような死にゆく細胞ではなく、正常な細胞におけるホスファチジルセリンのダイナミクスの制御機構およびその生理機能を明らかにすることを目的とする。一過的かつ局所的なホスファチジルセリンの分布変化の分子メカニズムの解明およびこのような分布変化がどのように免疫細胞の活性化や化学走性、細胞極性に関わっているか、その調節機構をflippaseであるP4-ATPaseの制御メカニズムを中心に解析する。ATP11Cが、Ca2+シグナルによってPKCが活性化されるとエンドサイトーシスされることで細胞膜から隔離され、細胞膜のPS-フリップ活性が低下することを見出した。そのメカニズムとしてPKCによってATP11CのC末端がリン酸化されることでエンドサイトーシスに必須なジロイシンモチーフが形成され、クラスリンによって細胞内に取り込まれることを明らかにした。エンドソームに取り込まれたATP11CはCa2+シグナルがなくなると再び細胞膜へリサイクルされることを発見した。したがって、ATP11Cはシグナル依存的に細胞膜から隔離されるが、その後細胞膜に戻ることで細胞膜の脂質非対称性の恒常性を担っていることが考えられた。さらに、このようなATP11Cのエンドサイトーシスによる活性調節は、GPCRのセロトニン受容体やヒスタミン受容体の活性化によるCa2+シグナルによって制御されることも明らかにした。したがって、このようなGPCRの活性化シグナルの下流でATP11Cの活性が調節され、細胞膜のPSの非対称性が制御されていることが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
当初の研究計画通り研究が進み、これらの研究成果をNat Commun誌に発表し、プレスリリースを行った。研究実施計画通り、メンブレントラフィックによるP4-ATPaseのATP11Cの活性調節機構を解明した。すなわち、Ca2+シグナルによるPKC活性化によってエンドサイトーシスされ、細胞膜から隔離されることで細胞膜のPS-フリップ活性が低下することを明らかにした。さらにPKCによってATP11CのC末端がリン酸化されることでエンドサイトーシスに必須なジロイシンモチーフが形成され、クラスリンによって細胞内に取り込まれることを明らかにした。続いてエンドソームに取り込まれたATP11CはCa2+シグナルがなくなると再び細胞膜へ戻ることを発見した。さらに、このようなATP11Cのエンドサイトーシスによる活性調節は、GPCRのセロトニン受容体やヒスタミン受容体の活性化によるCa2+シグナルによって制御されることも明らかにした。
ATP11Cのスプライスバリアントが極性細胞において極性局在を示すことを発見した。またこのバリアントはPKC活性化によってエンドサイトーシスされないことが分かった。したがって、ATP11Cのアイソフォームの活性はそれぞれ異なるメカニズムで調節されることが考えられた。さらに、極性を持つ細胞において一時的かつ局所的なPS露出が起こる可能性も考えられた。そこで、この極性局在のメカニズムを明らかにするためにスクリーニングを通じて特異的に結合するタンパク質を同定していく。また、その結合タンパク質によるATP11Cの局在、さらにはフリップ活性の調節の有無についても検討し、ATP11Cアイソフォームの極性局在および活性調節のメカニズムの解明を目指す。さらに、ATP11Cバリアントが細胞膜の局所においてPS露出を調節しているか、またそのメカニズムを調べていく。ATP11Cのアイソフォームの極性局在は運動能の高い細胞で見られたため、CRISPR/CAS9システムによりATP11Cをノックアウトし、その運動能を調べるとともにノックアウト細胞にそれぞれにアイソフォームのみを発現する細胞を作製し、運動能への影響および結合タンパク質との関連について調べていく。
すべて 2017 その他
すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 2件、 招待講演 1件) 備考 (1件)
Nature Communications
巻: ８ ページ: 1423
10.1038/s41467-017-01338-1
Scientific Reports
巻: 7 ページ: 13925
10.1038/s41598-017-14129-x.
http://www.pharm.kyoto-u.ac.jp/hshin/ShinIndex.html
