膜蛋白質を耐熱化させるアミノ酸置換の理論的予測法の確立

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H03663
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 木下 正弘 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (90195339)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 膜蛋白質 / アミノ酸置換 / 耐熱化 / G蛋白質共役型受容体 / ロドプシン

研究実績の概要

（１）G蛋白質共役型受容体(GPCR)の耐熱化に繋がるアミノ酸置換の理論的同定法の確立に向けて我々が開発した自由エネルギー関数は，現在までにクラスAの不活性型の安定化において多くの成果を挙げてきたが，活性型に対してはまだ実績が無かった。自由エネルギー関数の活性型への適用性を調べるため，A2aRの野生型と試行錯誤的に他の研究グループが得た安定化4置換体の活性型に対し，後者の方が確かに安定であることを示せた。上記自由エネルギー関数が活性型にも適用できることが分かった。
（２）上記の理論的同定法をGPCR以外の一般の膜蛋白質にも適用できるように拡張した。膜内部位のみならず水中部位をも含めた新しい自由エネルギー関数を構築した。TR (thermophilic rhodopsin)は膜蛋白質としては例外的に高い熱安定性を持つ。TRとXR (xanthorhodopsin)は高いアミノ酸配列相同性と立体構造の類似性を有するにも拘わらず，TRの熱安定性はXRのそれよりも遥かに高い。新しい自由エネルギー関数を用いて，TRの方が遥かに安定であることを示すと共に，そのような違いが生じる物理要因を特定することが出来た。
（３）GPCRのように本来安定性の低い膜蛋白質の安定化と異なり，TRのようにアミノ酸配列がほぼ最適化された膜蛋白質を本来の機能を保持させつつ安定化することは非常に難しいと考えられる。後者に対して有効と考えられる別の耐熱化アミノ酸置換の理論的同定法を考え，それをTRに適用することにより，機能を保持させつつより安定にする単置換を1つ発見した。今後，多重置換を用いてさらなる安定化が実現できれば，TRを新しい高機能性材料として使用できるものと期待される。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

耐熱化に繋がるアミノ酸置換の我々の理論的同定法が，GPCRの不活性型のみならずGPCRの活性型や広く一般の膜蛋白質にも適用できるように拡張できた。特に，それを用いてTRのさらなる耐熱化を本来の機能を保持させつつ実現できたことは注目に値する。

今後の研究の推進方策

（１）Class Aの活性型A2aR（GPCRの一種）に対し，耐熱化に繋がるアミノ酸置換をすでに理論的に予測しているが，それらによって実際に耐熱化が得られるか否かを実験で確認する。
（２）あらゆる膜蛋白質に対して，糖やアルコールなどの共溶媒の添加が熱安定性に及ぼす影響を調べる。理論解析によって，水溶性蛋白質の場合と同様に，スクロース①・グルコース②・マニトール③・エリスリトール④・グリセロール⑤の添加は安定化向上に繋がり，その強さは①>②~③>④>⑤の順番に従い，プロパノールの添加は安定化低下をもたらすことを予言している。TRとGPCRの一種であるA2aRに対して，このことを実験で確認する。
（３）RxRとHsBR（いずれもロドプシンに属する）はアミノ酸配列が似ているにも拘わらず，RxRの方が遥かに熱安定性が高い。本研究でRxRの結晶構造を初めて解いたが，驚いたことに，HsBRと視覚的にほとんど同じ立体構造であった。こうしたことは膜蛋白質でしばしば見られる。熱安定性を議論できるのは熱力学である。立体構造という幾何学的特性と熱力学をどのように結びつけるかは，生化学における未解決の重要課題である。各原子のx-y-z座標と力場パラメータのみから熱安定性を評価できる方法論を構築し，RxRとHsBRなる顕著な例に適用してその有効性を実証する。
（４）（１）および（３）で用いる理論は類似している。理論解析結果と実験結果が合わない場合には理論の改良を行う。（２）で用いる理論はこれらとは別のものである。やはり，理論解析結果と実験結果が合わない場合には理論の改良を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Analyses Based on Statistical Thermodynamics for Large Difference between Thermophilic Rhodopsin and Xanthorhodopsin in terms of Thermostability (2019)
  • 著者名/発表者名: S. Yasuda, T. Hayashi, Y. Kajiwara, T. Murata, M. Kinoshita
  • 雑誌名: Journal of Chemical Physics 巻: 150 ページ: 055101(1-12)
  • DOI: 10.1063/1.5082217
  • 査読あり
• [雑誌論文] An Accurate and Rapid Method for Calculating Solvation Free Energies of a Variety of Solutes Including Proteins (2019)
  • 著者名/発表者名: S. Hikiri, T. Hayashi, M. Inoue, T. Ekimoto, M. Ikeguchi, M. Kinoshita
  • 雑誌名: Journal of Chemical Physics 巻: 150 ページ: 175101(1-12)
  • DOI: 10.1063/1.5093110
  • 査読あり
• [雑誌論文] Physical Origin of Thermostabilization by a Quadruple Mutation for the Adenosine A2a Receptor in the Active State (2018)
  • 著者名/発表者名: Y. Kajiwara, S. Yasuda, S. Hikiri, T. Hayashi, M. Ikeguchi, T. Murata, M. Kinoshita
  • 雑誌名: Journal of Physical Chemistry B 巻: 122 ページ: 4418-4427
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.8b00443
  • 査読あり
• [雑誌論文] Universal Effects of Solvent Species on the Stabilized Structure of a Protein (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Hayashi, M. Inoue, S. Yasuda, E. Petretto, T. Skrbic, A. Giacometti, M. Kinoshita
  • 雑誌名: Journal of Chemical Physics 巻: 149 ページ: 045105(1-17)
  • DOI: 10.1063/1.504211110.1038/s41589-018-0131-3
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Ligand Binding to Human Prostaglandin E Receptor EP4 at the Lipid-Bilayer Interface (2018)
  • 著者名/発表者名: Y. Toyoda, K. Morimoto, R. Suno, S. Horita, K. Yamashita, K. Hirata, Y. Sekiguchi, S. Yasuda, M. Shiroishi, T. Shimizu, Y. Urushibata, Y. Kajiwara, ....., T. Hirokawa, M. Kinoshita, T. Murata, K. Takayama, M. Yamamoto, S. Narumiya, S. Iwata, T. Kobayashi
  • 雑誌名: Nature Chemical Biology 巻: 15 ページ: 18-26
  • DOI: 10.1038/s41589-018-0131-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Statistical Thermodynamics for Unexpectedly Large Difference between Disaccharide Stereoisomers in Terms of Solubility in Water (2018)
  • 著者名/発表者名: S. Hikiri, T. Hayashi, M. Ikeguchi, M. Kinoshita
  • 雑誌名: Physical Chemistry Chemical Physics 巻: 20 ページ: 23684-23693
  • DOI: 10.1039/c8cp04377a
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural Insights into the Subtype Selective Antagonist Binding to the M2 Muscarinic Receptor (2018)
  • 著者名/発表者名: R. Suno, S. Lee, S. Maeda, S. Yasuda, K. Yamashita, K. Hirata, S. Horita, M.S. Tawaramoto, H. Tsujimoto, T. Murata, M. Kinoshita, N. Vaidehi, M. Yamamoto, B. K. Kobilka, S. Iwata, T. Kobayashi
  • 雑誌名: Nature Chemical Biology 巻: 14 ページ: 1150-1158
  • DOI: 10.1038/s41589-018-0152-y
  • 査読あり
• [学会発表] サーモフィリックロドプシンとキサントロドプシンの熱安定性の大きな違いの統計熱力学的解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 安田賢司，林智彦，梶原佑太，村田武士，木下正弘
  • 学会等名: ImPACT野地プログラム「豊かで安全な社会と新しいバイオものづくりを実現する人工細胞リアクタ」最終成果報告会 ～人工細胞リアクタが拓くイノベーション～
• [学会発表] Identification of thermostabilizing mutations for G-protein coupled receptors: Rapid method based on statistical thermodynamics (2018)
  • 著者名/発表者名: S. Yasuda, Y. Kajiwara, Y. Takamuku, N. Suzuki, Y. Toyoda, K. Morimoto, R. Suno, S. Iwata, T. Kobayashi, T. Murata, M. Kinoshita
  • 学会等名: ImPACT野地プログラム国際シンポジウム“Artificial Cell Reactor Science and Technology”
• [学会発表] Radial distribution functions for hard sphere fluid calculated by MC and by an integral equation theory with a bridge function (2018)
  • 著者名/発表者名: Y. Nakamura, S. Arai, A. Yoshimori, M. Kinoshita, R. Akiyama
  • 学会等名: The 12th Mini-Symposium on Liquids (MSL2018)
  • 国際学会
• [学会発表] Diffusion coefficient of a large particle calculated by radial distribution functions in hard-sphere systems (2018)
  • 著者名/発表者名: Y. Nakamura, A. Yoshimori, S. Arai, M. Kinoshita, R. Akiyama
  • 学会等名: The 12th Mini-Symposium on Liquids (MSL2018)
  • 国際学会
• [学会発表] Structural and theoretical insights into the RNA-recognition mechanism by Musashi-1 (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Nagata, R. Iwaoka, T. Hayashi, K. Tsuda, N. Kobayashi, M. Kinoshita, M. Katahira
  • 学会等名: XXVIII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • 国際学会
• [学会発表] Statistical thermodynamics on the large difference between thermophilic rhodopsin and xanthorhodopsin in terms of thermostability (2018)
  • 著者名/発表者名: S. Yasuda, T. Hayashi, Y. Kajiwara, T. Murata, M. Kinoshita
  • 学会等名: 第79回岡崎コンファレンス
• [学会発表] Statistical thermodynamics on the large difference between maltose and cellobiose in terms of solubility in water (2018)
  • 著者名/発表者名: S. Hikiri, T. Hayashi, M. Ikeguch, M. Kinoshita
  • 学会等名: 第56回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Physical origin of the large difference between MDM2-p53NTD and -MIP complexes in binding free energy (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Yamada, T. Hayashi, N. Kobayashi, H. Yanagawa, M. Katahira, T. Nagata, M. Kinoshita
  • 学会等名: 第56回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Effects of solvent species on the stabilized structure of a protein (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Hayashi, M. Inoue, S. Yasuda, E. Petretto, T. Skrbic, A. Giacometti, M. Kinoshita
  • 学会等名: 第56回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Statistical thermodynamics for the extremely high thermostability of a microbial rhodopsin from the eubacterium Rubrobacter (RxR) (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Hayashi, S. Yasuda, K. Suzuki, T. Akiyama, K. Kanehara, Y. Sudo, T. Murata, M. Kinoshita
  • 学会等名: 第56回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Physical origin of exceptionally high thermostability of thermophilic rhodopsin (2018)
  • 著者名/発表者名: S. Yasuda, T. Hayashi, Y. Kajiwara, T. Murata, M. Kinoshita
  • 学会等名: 第56回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Thermostabilization of the microbial rhodopsin TR by carotenoid binding and amino-acid mutation (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Akiyama, K. Nishikawa, S. Nemoto, S. Yasuda, D. Umeno, M. Kinoshita, Y. Sudo, T. Murata
  • 学会等名: 第56回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 理論計算と進化工学を融合した効率的なGPCR安定化変異体スクリーニング系の構築 (2018)
  • 著者名/発表者名: 佐藤愼吾，鈴木七緒，梶原佑太，安田賢司，仲井宏紀，一色衣香，松浦友亮，木下正弘，村田武士
  • 学会等名: 日本分子生物学会年会
• [学会発表] 理論計算と進化分子工学を融合したGPCR安定化変異体スクリーニング系の構築 (2018)
  • 著者名/発表者名: 佐藤愼吾，鈴木七緒，梶原佑太，安田賢司，仲井宏紀，一色衣香，松浦友亮，木下正弘，村田武士
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第44回討論会
• [学会発表] メラトニン1A受容体の高発現・熱安定化改変体の創出 (2018)
  • 著者名/発表者名: 扇谷和希，佐藤愼吾，鈴木七緒，安田賢司，白石充典，木下 正弘，村田武士
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第44回討論会
• [学会発表] GPCR活性型変異体スクリーニング系の構築 (2018)
  • 著者名/発表者名: 中野僚介，肥喜里志門，安田賢司，白石充典，木下正弘，村田武士
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第44回討論会
• [図書] Springer Briefs in Molecular Science (2018)
  • 著者名/発表者名: M. Kinoshita
  • 総ページ数: 21
  • 出版者: Springer
  • ISBN: 978-981-10-8458-4
• [備考] 木下研究室－京都大学エネルギー理工学研究所
  • URL: http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/centerbunya/kinoshita/