研究課題
本研究は、ゼブラフィッシュの体表模様を研究対象とし、細胞自律的なパターン形成のメカニズムの解明を目指す。特に、パターン形成時に起こる同種色素細胞集団の形成及び異種色素細胞集団間の境界決定という事象に注目し、その分子メカニズムの解明を目指すものである。分子としては、体表模様変異体の解析から得られ、細胞間相互作用に重要な分子であるギャップ結合蛋白質、Connexin41.8とConnexin39.4に注目しその機能解明を進めている。また、独立して得られ、ともに細胞間相互作用に重要な分子であるNotch-Deltaとの関係を解明していく。本年度はまず、NGS解析とRT-PCR解析により色素細胞に発現するコネキシンタンパク質について発現解析を行い、黒色素胞及び黄色素胞に発現するコネキシンがCx41.8とCx39.4のみであることを明らかにした。また、色素細胞特異的に発現を誘導するプロモータであるmitfa-proとaox5-proを用いて遺伝子発現を誘導し、色素細胞ごとにコネキシンタンパクを異所的に発現する遺伝子組換えゼブラフィッシュ系統を確立した。これらの系統の交配を繰り返し、２種類の色素細胞と２種類のコネキシンの発現の組み合わせを検討し、体表模様形成に必須となるギャップ結合ネットワークの再構築を行った。また、その酌み交わせと表現型の比較から、それぞれの色素細胞におけるそれぞれのコネキシンの機能に関しての解析を行った。これらの結果をまとめて、ストライプパターン形成に必要なコネキシンの最小条件（ギャップ結合回路）を明らかにした。
2: おおむね順調に進展している
遺伝子組換え体の交配を繰り返して４重遺伝子導入体の作成するのに時間がかかったが、この作成を完了し、導入遺伝子と表現型の比較解析のための準備ができた。この遺伝子組換え体系統を用いて、一重遺伝子導入体、二重遺伝子導入体の各系統との比較を行った。その結果、黒色素細胞、黄色素細胞、それぞれの細胞における二種類のコネキシン遺伝子、Connexin41.8とConnexin39.4の組み合わせ及び単独での機能を明らかにすることができた。また、黄色素細胞間に発現するコネキシンは、ギャップ結合本来の機能としてだけではなく、細胞接着因子としての機能が重要であることを明らかにした。これまでの研究により、色素細胞は免疫染色に適さず、蛋白質レベルの局在を検出することが困難であった。特に、ギャップ結合は細胞仮足の先端に局在し、ここで機能していることが予行され、タンパク質の検出は困難が予想された。また、コネキシンタンパク質のC末に蛍光蛋白であるGFPを融合するとコネキシンとしての機能に影響が表れ、in vivo、in vitro両者の実験で結果が得られていなかった。そこで今回、分子解剖を行い、コネキシンタンパク質の内部にGFPを挿入し、あるいは部分的に欠損させた変異体を作製しGFPとの融合タンパク質をデザインした。その結果、この融合コネキシンは変異体の体表模様を相補することができ、タンパク質の局在の解析にも有効であることが明らかとなった。。また、Connexin39.4に関してはパッチクランプによる整流性解析を完了し、黒色素細胞に存在すると予想されているスペルミジン依存的なギャップ結合の整流性を確認することができた。これらの結果をまとめた論文を執筆し、近々投稿する予定である。
細胞間相互作用に関わる新規分子の検索について、NGS解析により得られた遺伝子群に注目し、遺伝子破壊を進行しているが、現在のところ候補遺伝子が取得できていないので、引き続き遺伝子破壊系統の作成を続ける。Connexin41.8とConnexin39.4に関して、細胞特異的なコネキシン発現と、コネキシンタンパク質に変異を導入することにより、どのようなギャップ結合が細胞間相互作用に関与しているのか、より詳細なデータの取得を目指す。黒色素細胞集団の集団サイズの規定に関与していると考えられるNotch-Deltaシグナルについて、二重変異体の表現型からConnexin41.8の下流にあるのではないかと考えられる。しかし一方で、Connexin39.4の変異による影響は受けないことが分かってきた。この差がどこにあるのかについて、H３０年度に得られた知見と照らし合わせて明らかにしていく
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