| 研究課題/領域番号 |
17H03692
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
和田 元 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (60167202)
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| 研究分担者 |
三芳 秀人 京都大学, 農学研究科, 教授 (20190829)
小林 康一 大阪府立大学, 高等教育推進機構, 准教授 (40587945)
安部 真人 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (30543425)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 合成脂質プローブ分子 / 脂質輸送メカニズム / 脂質輸送タンパク質 / シロイヌナズナ / ゼニゴケ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、合成脂質プローブ分子を用いた斬新でユニークな生化学・分子生物学的な解析によって脂質輸送体の同定および機能解析を行い、脂質の輸送メカニズムを解明することを目指している。本年度は、バイオインフォマティックスの手法によって同定した小胞体とミトコンドリアの接触部位において脂質の輸送に関わっていると推定されているタンパク質について解析を行った。まず、同定したタンパク質のうち、大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させることに成功したSLMO-TRIAPについて精製を行い、それらの発現タンパク質について脂質との結合能を調べた。その結果、精製したタンパク質にはPEやPGなどの大腸菌が持っている脂質が結合していたが、シロイヌナズナから抽出した脂質のリポソームと混ぜるとガラクト脂質と結合することがわかった。このタンパク質は酵母では、ミトコンドリアの外膜から内膜へPAを輸送することが報告されているが、シロイヌナズナのタンパク質はガラクト脂質の輸送に関わっていることが示唆された。次に遺伝子が破壊された変異体を調べたところ、リン欠乏下での生育が野生株に比べて悪いことから、リンが欠乏したときに起こるDGDGの色素体外への輸送に関わっている可能性がある。他のタンパク質についても同様の解析を行っている。一方、合成脂質プローブ分子を用いた解析も行った。昨年度は、タンパク質と光架橋させるためのタグやクリック反応をおこさせるためのタグを導入した、PCとPGの脂質プローブ分子の合成に成功した。しかし、そのプローブを用いてPCとPGに特異的に結合するタンパク質をゼニゴケとシロイヌナズナから同定することを試みたが、同定には至らなかった。本年度は、光架橋やクリック反応の条件を検討し、最適な条件を見出すことに成功した。今後、その条件のもとで、PCとPGに特異的に結合するタンパク質の同定を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
バイオインフォマティックスの手法によって脂質の輸送に関わっていると推定されているタンパク質の遺伝子をゼニゴケとシロイヌナズナから見つけ出し、それらの遺伝子にコードされたタンパク質を大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させることに成功した。それらのタンパク質と脂質との結合解析や変異体を用いた機能解析は概ね順調に進んでいるが、合成脂質プローブ分子を用いた解析がやや遅れている。タンパク質と光架橋させるときの条件やクリック反応の条件を最適化するのに時間がかかってしまった。最適化についてはクリヤーできたので、今後はその条件で実験を進めることで、研究が順調に進むものと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
バイオインフォマティックスの手法によって同定したタンパク質について、大腸菌において水溶性のタンパク質として発現させたものを用いて、特定の脂質と特異的に結合するタンパク質、特にPGやPCと特異的に結合するタンパク質の同定を進める。合成脂質プローブ分子を用いた解析については、タンパク質と光架橋させるときの条件やクリック反応の条件を最適化することができたので、それらの条件のもとでPCとPGに特異的に結合するタンパク質の同定を行う。２つの解析によってPGやPCと特異的に結合するタンパク質が同定できたら、GFPとの融合タンパク質をシロイヌナズナで発現させて細胞内局在性を明らかにする。また、それらのタンパク質の中から、脂質の輸送活性をもつものをin vitroのアッセイ系を使って選別するとともに、 脂質との結合や輸送活性に必要なドメインを同定し、輸送メカニズムを明らかにする。さらに、 オルガネラ間の脂質輸送と脂質の部位特異的な機能を解明する。
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