| 研究課題/領域番号 |
17H03707
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
森 稔幸 順天堂大学, 医学部, 助教 (00462739)
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| 研究分担者 |
平井 誠 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50326849)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 有性生殖 / GCS1 / 受精因子 / 膜タンパク質 / 配偶子 / 細胞間相互作用 / マラリア / 媒介蚊 |
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| 研究実績の概要 |
・雄性配偶子受精因子GCS1と相互作用する雌性配偶子因子の探索
マラリア原虫オス配偶子側受精因子GCS1のメス側パートナー分子を同定するべく、GCS1-BioID2(改変biotin ligase)を細胞外へ分泌される分子としてメス配偶子特異的に発現する遺伝子組換ネズミマラリア原虫の作製を行った。GCS1の完全長細胞外ドメイン、GFP、BioID2の3者を連結した融合遺伝子eGBをメス特異的プロモーター下で発現させたところ、メス特異的eGB分子の発現を確認した。ネガティブコントロールとしてGCS1のシグナル配列のみを用いたsGB分子を発現する株も作製し、eGB株特異的ビオチン化タンパク質の探索を行った。ビオチン化タンパク質画分をSDS-PAGE後に銀染色したところ、eGBで特異的なバンドを検出することに成功した。
・媒介蚊体内における配偶子挙動観察法の確立
マラリア原虫感染マウスから吸血した蚊において、その体内で原虫の有性生殖を透視観察する実験系の開発を試みた。メス配偶子を特異的に赤色蛍光、オス配偶子とasexual細胞を緑色蛍光タンパクで標識したネズミマラリア原虫株を作製し、感染マウスを媒介蚊に吸血させ、吸血後の蚊をCUBIC reagentsで処理した。その結果、吸血後の血液色素の除去と蚊組織の透明化に成功し、中腸内でのメス配偶子の挙動を視覚化することに成功した。本成果は、英科学誌Scientific Reportsに発表された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
オス配偶子にGCS1-BioID2を発現させ、in vitro受精時にメス側パートナー分子をビオチン化させるという当初の試みはあまり能率的ではなかったため、2018年度はメス配偶子に分泌型GCS1-BioID2を発現させ、自己の中でメス配偶子パートナー・GCS1相互作用を起こさせるという改善を行い、それに成功した。
また、本計画の柱の一つである蚊の体内におけるマラリア原虫挙動の透視観察法が確立され、論文発表できたことから表記の評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
2018年度に成功した、分泌型GCS1-BioID2発現株(eGB発現株)を駆使し、ビオチン化されたGCS1のメス側パートナー候補を質量分析よって解析する。
また、これまでの蚊の透視観察法で未だできていない雌雄配偶子の相互作用観察を実現すべく、オス配偶子の高感度な蛍光マーカー株の開発に着手する。
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