| 研究課題/領域番号 |
17H03710
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| 研究機関 | 早稲田大学 |
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研究代表者 |
岡野 俊行 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (40272471)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | クリプトクロム / 光受容体 / 磁気受容 / モノクローナル抗体 |
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| 研究実績の概要 |
申請書に記載の研究計画に基づき下記の研究を行った。
【１】光・磁気受容体クリプトクロムの立体構造の決定：酵母を用いて高純度のクリプトクロムを大量に得ることに成功したことを受けてこれまでに、多数の条件をスクリーニングしたものの結晶は得られていない。そこで、構造が安定しないと推定されるカルボキシ末端郎行きを削った多数の変異体を用いて、さらに検討したものの結晶は得られなかった。そこで、引き続き条件を検討続けると共に、結晶化に替わる構造推定手段としてMD計算を用いて立体構造を推定した。推定した構造を元に、光反応に伴う発色団近傍の電子移動を推定し、変異体を作成・解析した。
【２】光・磁気受容体クリプトクロムの光反応機構の解析：光を受容した直後の光反応を検討するために、ミリ秒分光法を用いた解析を行った。ここでは、中間体を含めた詳細な光反応過程を推定するため、特異値分解法を利用した解析を行った。その結果、興味深いことに光照射直後において、これまで観察された中性ラジカルの前駆体であるアニオンラジカル体がサブミリ秒スケールで安定に生じていることが判明した。アニオンラジカル体が他のクリプトクロムよりも安定に存在していたことから、アニオンラジカル体の形成前後において高効率の磁気応答反応が起こっている可能性が考えられた。
【３】光・磁気受容体クリプトクロムの光依存的な磁気応答反応の検出：クリプトクロムの磁気応答反応の検出には、クリプトクロムを分子レベルで一定方向に並べることが重要である。そこで、これまでに得たモノクローナル抗体の一本鎖抗体を大腸菌において大量に発現し、変性・再生を経て高純度に得ることに成功した。特に、クリプトクロムのカルボキシ末端を認識するC13抗体は、温度変化に応じて結合力が変化することが判明したため、この性質を利用して、タンパク質精製・可逆的固定化を行う基本技術を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
クリプトクロムの結晶化について条件検討を続けるのと並行して、その過程で確立した高純度試料の精製方法を利用することによって、これまで不可能であった高速分光が可能となった。現在は、発現量の少ない変異体の大量精製も可能となりつつあり、結晶構造は確定できていないものの、光反応過程を知るために必須の高濃度試料が得られた点が、今後の研究展開の大きな突破口となっており、その点が大きな進展である。
また、クリプトクロムアフィニティー精製方法の詳細な検討過程において、温度感受性の一本鎖抗体を用い、温度変化によって高純度タンパク質精製が可能となった。この方法は他のクリプトクロムにも応用可能であると同時に、タンパク質の固定化技術にもつながる可能性があり、以上を総合して、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究１の結晶化に関してはひきつづき条件検討をつづける。具体的には、これまで用いてきた酵母以外の宿主にも広げて純度の高いタンパク質の精製を試みる。また、立体構造解明のリスクも考え、MDシミュレーションで得られた予測立体構造の正しさについて、変異体の光反応解析と酵素部分分解解析、ならびに、反応する抗体のエピトープ解析などを合わせて、総合的に評価・検討する。
研究３の磁気応答反応の検出には、分子固定化技術と光反応の検出技術の両方の確立が必要であり、これまでにない新規の技術開発が必要と考えられた。高速分光法を導入することによって、分子固定を行わずとも、磁気効果を検出できる可能性が考えられた。そこで、光反応の検出にやや重点を置きたい。つまり、固定化方法はひきつづき検討しつつも、並行して蛍光等を用いてクリプトクロムの構造変化のリアルタイム検出ができないかを検討する予定である。
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