| 研究課題/領域番号 |
17H03710
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| 研究機関 | 早稲田大学 |
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研究代表者 |
岡野 俊行 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (40272471)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | クリプトクロム / 光受容 / 磁気受容 / モノクローナル抗体 |
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| 研究実績の概要 |
申請書に記載の研究計画に基づき下記の研究を行った。
【１】光・磁気受容体クリプトクロムの立体構造の決定：前年度に引き続き、結晶化条件を検討したが、結晶は得られなかった。一方、ハト由来のCRY4の部分タンパク質の立体構造が発表されたため、この構造をもとに、分子モデリングならびにMD計算を用いて立体構造を推定した。また、結晶化に向けて、これまで酵母を用いて行なってきた発現に加えて、大腸菌を用いた系を検討した。その結果、タンパク質可溶化能の高い大腸菌を用いて、活性のあるCRY4を発現することに成功した。
【２】光・磁気受容体クリプトクロムの光反応機構の解析：検討していた推定した構造を元に、光反応に伴う発色団近傍の電子移動を踏まえ391番目のアスパラギンを他のアミノ酸に置換した点変異体を複数作製した。この光反応を解析した結果、セリンへの変異体では、野生型ではミリ秒スケールで分解するアニオンラジカル体で安定となり、アスパラギン酸への変異体では、中性ラジカル体が安定となることがわかった。現在、これまで野生型を用いてきたのと同様に、ミリ秒分光法ならびに、特異値分解法を利用した解析を行っている。また、カルボキシル末端付近の配列がクリプトクロムの光依存的な構造変化に及ぼす影響を検討した。
【３】光・磁気受容体クリプトクロムの光依存的な磁気応答反応の検出：クリプトクロムの磁気応答反応の検出には、クリプトクロムを分子レベルで一定方向に並べることが重要である。また、カルボキシル末端付近が構造変化するため、カルボキシル末端付近に任意の分子を付加することが重要である。そのためにこれまで、クリプトクロムのカルボキシル末端に対するモノクローナル抗体の一本鎖抗体(THETAL)を作製してきた。THETALおよびTHETALを複数回繰り返し配列にしたタンパク質を大腸菌発現し、変性・再生する方法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
クリプトクロムの結晶化についてはやや難航しているものの、その過程で大腸菌を用いた新たな発現系を構築することができた。大腸菌での発現系は、結晶化のみならず、タンパク質の特異的ラベリング等に応用することができる。また、クリプトクロムの構造保存性の高さから鑑みて、データベース中の構造情報にもとづく予測構造からフォトリアーゼドメインの構造は予測できた。一方、機能的に重要であるカルボキシル末端付近の構造は未だ発表されていないが、この領域が柔軟に変化し光反応過程に影響することを実験的に示すことができた。また、分子動力学シミュレーションを用いることによって、一本鎖抗体との結合を予想することができ、クリプトクロムの固定化方法の検討が進んでいる。このように、より動的な構造変化に注目した解析を進めている点が、当初の予想を超えた進展であり、以上を総合して、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究１の構造解析は、カルボキシルの動的構造変化に注力し、分子動力学シミュレーションで得られた予測立体構造と酵母ツーハイブリッドスクリーニングで得られた相互作用タンパク質との相互作用部位の解析を合わせて、総合的に評価・検討する。
研究２の光・磁気受容体クリプトクロムの光反応機構の解析は、これまでに得られた変異体の大量培養を進め、高速分光法によるさらなる解析を進める。それに加え、ヌクレオチドなどの小分子が、FAD発色団と相互作用する可能性が予想されているため、小分子リガンドの有無による光反応の変化ならびに、予測分子構造にもとづくリガンド結合部位の変異体を作成し、野生型との違いを詳細に検討する。
研究３の磁気応答反応の検出には、分子固定化技術と光反応の検出技術の両方の確立が必要である。このための一本鎖抗体を生物工学的に改変して、効率的な固定化を模索する。また、クリプトクロムの光依存的な構造変化のリアルタイム検出には、変異体と部分ペプチドに蛍光を付加したタンパク質を作製し、構造変化に伴ってFRET効率が変化するような分子を模索する。
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