| 研究課題/領域番号 |
17H03713
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
中山 潤一 基礎生物学研究所, クロマチン制御研究部門, 教授 (60373338)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 遺伝子 / 発現制御 / ヘテロクロマチン / 分裂酵母 / ユビキチン化 |
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| 研究実績の概要 |
真核生物の染色体機能に必須なヘテロクロマチン形成の分子メカニズムの解明を目指して、本年度は以下の2つの研究項目の研究を遂行した。
【1】ヒストンH3のユビキチン化の動態解析：先行して実施した研究によって、分裂酵母のヒストンメチル化酵素であるClr4を含むCLRC複合体が、in vitroのアッセイ系においてヒストンH3をユビキチン化する活性を持つことを明らかにした。実際に分裂酵母内のH3のユビキチン化の動態を明らかにするため、ユビキチン化H3に特異的な抗体の作製を試みた。14番目のリジンにユビキチン化が付加された状況を模したGGを付加した分岐ペプチドに対する抗体を作製し、候補として得られた抗体の検討を進めた。実際に分裂酵母の抽出液に対してウェスタンブロットをした結果、ユビキチン化H3に相当するような位置にシグナルが検出されたが、これがK14にユビキチンが付加されたH3を特異的に認識しているかどうかの最終的な確認はできなかった。
【2】ユビキチン化によるClr4メチル化の制御：先行する研究によってユビキチン化修飾の存在によってClr4のメチル化活性が促進されることを見出した。本年度はClr4の中でこの促進に関わるドメインの特定を試みた。各ドメインを欠失したClr4をリコンビナントタンパク質として発現させ、この部分欠失Clr4を用いてin vitroメチル化アッセイを行った。その結果、N末端のクロモドメインとその近傍の領域を欠損させたClr4では、ユビキチン化H3に対する嗜好性が失われていることが明らかになった。この結果より、Clr4のN末端側の領域がユビキチン化H3の認識とClr4の活性制御に関与していることが強く示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
作製した抗体が実際に14番目のリジンがユビキチン化されたH3を認識しているかどうか最終的な確認までできなかったが、この抗体を用いたウェスタンブロットによって野生型とCLRC変異体で変化があるように見えることから、有用な抗体を得た可能性が十分考えられるため。また、Clr4の活性制御にN末端側の領域が関与していることを明らかにできたことは重要な成果であり、今後どのように活性制御が行われているのか研究の発展が期待できるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究で作製した抗体の有用性の検討を引き続き進める。候補抗体を用いた解析と平行して、セントロメア近傍領域のヒストン修飾の状態をモニターできるような系の構築を進め、ユビキチン化の動態解析を引き続き進める。
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