| 研究課題/領域番号 |
17H03768
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
杉山 慶太 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 北海道農業研究センター, グループ長 (30414767)
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| 研究分担者 |
志村 華子 北海道大学, 農学研究院, 講師 (20507230)
鈴木 卓 北海道大学, 農学研究院, 准教授 (30196836)
実山 豊 北海道大学, 農学研究院, 講師 (90322841)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 単為結実 / スイカ / 花粉 / ユウガオ |
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| 研究実績の概要 |
スイカ雌蘂とユウガオ花粉の組み合わせに限定してみられる、異属花粉による単為結実の発生メカニズムを解明するため、受粉後のスイカ子房内における花粉管の動態を経時的に観察した。ユウガオ花粉の花粉管の先端は子房上部にまで到達するが、スイカ花粉のような胚珠内への侵入は確認されず、単為結実を引き起こさないニガウリ花粉と同様であった。しかし受粉後の子房肥大の様子は、スイカ花粉受粉時と同様であり、花粉管の到達位置と子房肥大の関係性は小さいことが考えられた。
植物ホルモンの関与を明らかにするために、スイカ、ユウガオ、ニガウリなどの花粉内のホルモン及び受粉後のスイカ子房内のホルモン変動を解析した。ユウガオ花粉のIAA含量は他の作物より多い特徴がみられた。サイトカイニンでは、Isopentenyladenin量が多く含まれていた。また、ABA含量は最も低かった。スイカへの異属花粉の受粉後12時間から72時間までの子房内でのABAは、スイカ受粉区とユウガオ受粉区で類似の変動傾向が認められた。以上のことから、花粉内のオーキシン、サイトカイニンの関与、受粉後の子房内でのABA変動などが関与している可能性が考えられた。
スイカとユウガオどちらの花粉も子房に到達する受粉48時間後、また、果実肥大が明確になる受粉72時間後の果実を材料とし、total RNAを抽出してRNAseqを行い、通常受精と単為結実とで果実肥大過程の発現変動遺伝子に違いがあるのかを調べた。その結果、果実肥大時の発現変動遺伝子は、スイカ花粉を受粉した場合よりもユウガオ花粉を受粉した場合のほうが多く、特にオーキシン関連遺伝子がユウガオ花粉を受精した果実で多く変動していた。一方、サイトカイニンなど他の植物ホルモンに関わる遺伝子の発現変動には大きな違いがなく、ユウガオ花粉によるスイカの単為結実にオーキシンが大きく関わることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画通りスイカ花柱および子房の切片をアニリンブルー染色して花粉管を可視化し、スイカ雌蘂への各花粉受粉後の花粉管伸長の様子を観察した。受粉12時間から36時間後において、スイカ、ユウガオ、ニガウリの花粉管が花柱内を伸長し、子房上部に到達している様子が認められたが、受粉48時間後において花粉管が胚珠に到達しているのはスイカ花粉のみであることが確認できた。また受粉72時間後における子房形の縦/横比は、単為結実をするユウガオ花粉では、スイカ花粉と同様の1.35程度であったが、無受粉子房およびニガウリ花粉を受粉させた子房では1.25程度に変化し、子房肥大の様子が両者で異なる傾向であることが示された。
ホルモン解析においては、花粉内及び子房内のホルモンの解析を実施した。ユウガオに特徴的なホルモンとして、サイトカイン（Isopentenyladenin）が見いだされ、またオーキシン、アブシジン酸も影響している可能性が示唆されるなど、ほぼ予定通り進んでいる。
花粉内及び雌蘂内のタンパク質についてもプロテオーム解析を実施し、ユウガオの単為結実に関連するタンパク質の検索を進めている状況である。
単為結実性キュウリを用いたトランスクリプトーム解析では、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンが関わるという報告例があり、単為結実は通常受精と同様の遺伝子発現が関わるとされている。本研究ではスイカ単為結実に関わる遺伝子レベルの解析を行ったが、植物ホルモンの中でも特にオーキシンが単為結実の果実肥大に関わることが示唆され、また、果実肥大の前段階においては、通常受精と単為結実では異なる遺伝子発現変動が起きていることが示唆された。どのような遺伝子発現に違いがあるのか今後の詳細な解析にむけた手がかりを得ることができた。
以上のように、初年度としてはおおむね順調に進行していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
花粉管の到達位置とは無関係にスイカ子房肥大が起こるユウガオ花粉では、花粉管伸長時に、花粉管から何らかの内容物が浸出し、これらがニガウリ花粉とユウガオ花粉の結果率の差異を生んだ可能性が考えられたので、子房内における花粉管表面について、低真空SEMまたはCryo-SEM等を用い経時観察し、微細構造変化の有無を検証する。更に、伸長中の花粉管周囲における植物ホルモン局在を可視化するためのTOF-MS Imagingの予備実験として、受粉後子房の薄片切削についても試みる。
ユウガオ花粉に多く含有したサイトカイニンを受粉後のスイカ雌蘂に適用して子房肥大の有無を観察する。また、ユウガオ花粉のスイカへの受粉後、子房内での含量が低かったアブシジン酸についてもスイカ雌蘂への適用を行い子房肥大の効果を確認する。
受粉直前ならびに受粉後のスイカの子房を材料として、可溶性タンパク質を抽出し、単為結実と関連した挙動を示すタンパク質を電気泳動法により特定を進める。単為結実と連動するタンパク質スポットが特定できた場合は、MALDI-TOF MSを用いてその質量を明らかにするとともに、アミノ酸配列の特定を進める。
RNAseqによる解析では、ユウガオ花粉によって単為結実したスイカ果実では通常受精に比べてオーキシン応答関連遺伝子が大きく変動していることが示唆された。今後は、この結果について定量RT-PCRによって再現性を確認するとともに、実際に子房中のオーキシン量に違いがあるのか質量分析等も用いて確認する必要がある。また、今回は無処理（未受粉）など果実肥大しない条件の材料について解析できなかったため、今後はそのような材料を用意して解析する予定である。
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