研究課題
植物の生体防御システムには、一過的な応答であるPTI (Pattern-triggered immunity)と持続的で細胞死を伴うETI (Effector-triggered immunity) による２段階の免疫応答が存在する。いずれの場合もMAPキナーゼ (MAPK) が重要な役割を果たしているが、感染現場での活性化動態は不明である。申請者は、時空間的に細胞・組織レベルでMAPK活性動向をモニターするバイオセンサーの開発に成功した。実際の感染現場においては、被感染細胞のみでなく、周辺細胞による集団協調的な生体防御機構によって防御が実行されるが、その実態は依然として不明である。そこで、バイオセンサーを用いて病原菌の感染に応答したMAPK活性を可視化することによって、集団協調的な生体防御機構の実態を理解することを目的とした。本研究では、病原菌の感染に応答したMAPK活性を可視化することによって、PTIおよびETIにおける新たなシグナルネットワークの発掘を可能にする先駆的モデル系を提示する。平成29年度は、ジャガイモ疫病菌の宿主であるジャガイモ (Solanum tuberosum L.)と、モデル植物であるベンサミアナタバコ (Nicotiana benthamiana) にセンサー遺伝子を導入した組換えモニター植物を作製し、導入遺伝子が安定してタンパク質を高蓄積させる個体を獲得することを計画した。ベンサミアナタバコは、ウイルスベクターを用いた迅速な遺伝子のサイレンシングが可能であり、Avrエフェクター遺伝子と対応する抵抗性遺伝子をアグロバクテリウムを用いて一過的に導入することができる。ジャガイモ品種サヤカは遺伝子組換えに適した品種であり、ジャガイモ疫病菌抵抗性遺伝子としてR1およびR3を保持している。
3: やや遅れている
平成29年度は、ジャガイモ疫病菌の宿主であるジャガイモ (Solanum tuberosum L.)と、モデル植物であるベンサミアナタバコ (Nicotiana benthamiana) にセンサー遺伝子を導入した組換えモニター植物を作製し、導入遺伝子が安定してタンパク質を高蓄積させる個体を獲得することを計画した。ベンサミアナタバコは、ウイルスベクターを用いた迅速な遺伝子のサイレンシングが可能であり、Avrエフェクター遺伝子と対応する抵抗性遺伝子をアグロバクテリウムを用いて一過的に導入することができる。ジャガイモ品種サヤカは遺伝子組換えに適した品種であり、ジャガイモ疫病菌抵抗性遺伝子としてR1およびR3を保持している。植物にバイオセンサーを導入する場合、導入遺伝子のタンパク質が高蓄積することが重要である。そこで、YFPのコドンを置換することでCFPとの配列の重複を避け、さらにHSP90ターミネーターの採用によって、一過的な発現系においてはセンサータンパク質の高蓄積が確認された。pGreenベクターはゲノム内に多コピー導入されないことが示されており、複数コピー導入による遺伝子のサイレンシングを回避することが期待される。また、センサーのC末端に核外輸送シグナル (NES) あるいは核局在シグナル (NLS) を付加した。これら２つのバイオセンサーによって、細胞質基質や核でMAPK活性の動態をモニターすることができる。pGreenベクターを用いてベンサミアナタバコを形質転換し、多数の再生個体を得たが、導入遺伝子の発現を確認できる個体が得られなかった。ジャガイモについても得られた再生個体はすべてエスケープであった。
植物にバイオセンサーを導入したモニター植物には、YFPのコドンを置換した変異体、HSP90ターミネーターを採用した。また、pGreenベクターはゲノム内に多コピー導入されないことが示されており、複数コピー導入による遺伝子のサイレンシングを回避することが期待される。センサーのC末端に核外輸送シグナル (NES) あるいは核局在シグナル (NLS) を付加した。これら２つのバイオセンサーによって、細胞質基質や核でMAPK活性の動態をモニターすることができる。本年度は、p pGreenベクターを用いてベンサミアナタバコを形質転換し、多数の再生個体を得たが、導入遺伝子の発現を確認できる個体が得られなかった。そこで、ベンサミアナタバコの形質転換に実績があるpBin19ベクターをベースとしたpGWB2-Ωを用い、さらにHSP90ターミネーターをNOSターミネーターに変えて形質転換を試みている。また、ジャガイモについても得られた再生個体は、すべてエスケープであったため、pGWB2-Ωを用いて、同様に形質転換を試みている。今後、計画した細胞質基質または核に局在する２通りのバイオセンサーを導入したジャガイモ植物に、ジャガイモ疫病菌 (Phytophthora infestans) の親和性・非親和性レース、夏疫病菌 (Alternaria solani) を接種し、感染現場をFRET蛍光顕微鏡あるいは共焦点レーザー顕微鏡で観察する。同様に２通りのバイオセンサーを導入したベンサミアナ葉に、ジャガイモ疫病菌、ウリ類炭疽病菌 (Colletotrichum orbiculare)、灰色かび病菌 (Botrytis cinerea)を接種してFRET蛍光を観察する予定である。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 1件) 備考 (1件) 産業財産権 (1件)
Plant Cell
巻: 29 ページ: 775-790.
10.1105/tpc.16.00976
化学と生物
巻: 55 ページ: 590-592.
https://www.agr.nagoya-u.ac.jp/%7ebio4283/pg12.html
