研究課題
植物の生体防御システムには、一過的な応答であるPTI (Pattern-triggered immunity)と持続的で細胞死を伴うETI (Effector-triggered immunity) による２段階の免疫応答が存在する。いずれの場合もMAPキナーゼ (MAPK) が重要な役割を果たしているが、感染現場での活性化動態は不明である。申請者は、時空間的に細胞・組織レベルでMAPK活性動向をモニターするバイオセンサーの開発に成功した。実際の感染現場においては、被感染細胞のみでなく、周辺細胞による集団協調的な生体防御機構によって防御が実行されるが、その実態は依然として不明である。そこで、バイオセンサーを用いて病原菌の感染に応答したMAPK活性を可視化することによって、集団協調的な生体防御機構の実態を理解することを目的とした。本研究では、病原菌の感染に応答したMAPK活性を可視化することによって、PTIおよびETIにおける新たなシグナルネットワークの発掘を可能にする先駆的モデル系を提示する。植物にバイオセンサーを導入したモニター植物には、YFPのコドンを置換した変異体、HSP90ターミネーターを採用した。また、pGreenベクターはゲノム内に多コピー導入されないことが示されており、複数コピー導入による遺伝子のサイレンシングを回避することが期待される。センサーのC末端に核外輸送シグナル(NES) あるいは核局在シグナル (NLS) を付加した。これら２つのバイオセンサーによって、細胞質基質や核でMAPK活性の動態をモニターすることができる。平成３０年度は、C末端にNESを付加したMAPKセンサーをシロイネナズナを形質転換したところ、多数の再生個体を得ることができた。さらに、これらの個体からMAPKセンサーの発現が良好な個体を選抜することができた。
2: おおむね順調に進展している
植物免疫においてはMAPKカスケードが重要な役割を担っており、ベンサミアナタバコでは、病害応答性MAPKとしてSIPKとWIPKが同定されている。申請者はこれまでに、ベンサミアナタバコのSIPK/WIPKのリン酸化基質として、WRKY型転写因子であるWRKY8を同定した。WRKY8のN末端領域には、リン酸化の標的となる集積したSP配列 (SPクラスター)が存在する。本研究課題では、時空間的に細胞・組織レベルでMAPK活性動向をモニターするバイオセンサーを開発し、実際に病原菌が感染した細胞およびその周辺細胞による集団協調的な生体防御機構の実態を理解することを目的とした。本MAPKバイオセンサーは、WRKY8由来のDドメインとSPクラスター、ヒト由来のリン酸化セリン認識ドメイン (Pin1 WW)、そしてYFPとCFPを両端に連結した構造である。SPクラスターがMAPKにリン酸化されると、蛍光共鳴エネルギー移動 (Fluorescence Resonance Energy Transfer : FRET) が起こり、MAPK活性が蛍光シグナルとして観察できるようになる。本年度は、C末端にNESを付加したMAPKセンサーをシロイネナズナを形質転換したところ、多数の再生個体を得ることができた。さらに、これらの個体を細菌のべん毛タンパク質に由来するflg22で処理し、センサーの発現量およびリン酸化状態を抗体で検出することによって、MAPKセンサーが良好に機能する個体を選抜することができた。これらの結果は、本モニター植物を用いることによって、時空間的にMAPK活性を観察することが可能であることを示している。
平成３０年度は、MAPKセンサーのC末端に核外輸送シグナル(NES) を付加し、シロイネナズナを形質転換したところ、多数の再生個体を得ることができた。これらの個体を細菌のべん毛タンパク質に由来するflg22で処理し、センサーの発現量およびリン酸化状態を抗体で検出することによって、MAPKセンサーが良好に機能する個体を選抜することができた。これらの結果は、本モニター植物を用いることによって、時空間的にMAPK活性を観察することが可能であることを示している。今後、アブラナ科炭疽病菌 (Colletotrichum higginsianum) に対するMAPKの活性動態について、時空間的に蛍光顕微鏡あるいは共焦点レーザー顕微鏡で観察する予定である。さらに、本バイオセンサーを導入したベンサミアナ葉に、ジャガイモ疫病菌、ウリ類炭疽病菌 (Colletotrichum orbiculare)、灰色かび病菌 (Botrytis cinerea)を接種してFRET蛍光を観察する予定である。また、ジャガイモ疫病菌 (Phytophthora infestans)に対する抵抗性遺伝子であるRpi-blb2を形質転換したベンサミアナタバコ葉に、Avrblb2を持つ疫病菌を接種することで細胞死を伴うETI反応を誘導し、侵入細胞と近接細胞におけるFRET蛍光を観察する。これらの一連の観察によって、PTIおよびETIにおけるMAPKの活性動態を明らかにする。
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http://www.agr.nagoya-u.ac.jp/%7ebio4283/index.html
