| 研究課題/領域番号 |
17H03780
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
早川 俊彦 東北大学, 農学研究科, 准教授 (60261492)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 植物代謝調節 / 植物栄養学 / 遺伝子 / 酵素 / シグナル伝達 |
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| 研究実績の概要 |
窒素栄養は、植物の生育や生産性を支配する多量必須栄養である。水田栽培の主要穀物イネは、主にアンモニウム態窒素栄養を吸収・利用する。しかし、高濃度アンモニウム供給は、多くの陸上植物に有害である。植物は、根細胞内アンモニウム過負荷回避のため、アンモニウム供給濃度上昇に応答して根の高親和性アンモニウム吸収系(HATS)を転写・タンパク質レベルで負に制御するが、この詳細な分子機構は不明である。
昨年度の研究から、充足濃度のアンモニウムを与えたイネ幼植物の根では、セリン・スレオニン・チロシン タンパク質リン酸化酵素ACTPK1が高蓄積し、ACTPK1がHATSを構成するアンモニウム輸送体1;2 (AMT1;2)のC末端側の保存スレオニン残基をリン酸化して、AMT1;2を不活性化することを明らかにした。
今年度の研究から、試験管内リン酸化試験を用いて、組換えACTPK1タンパク質によるAMT1;2 のC末端側ポリペプチドの保存スレオニン残基のリン酸化活性に影響を与える低分子代謝産物を見いだした。また、イネ根由来の培養細胞のプロトプラストでの一過的なアンモニウム応答遺伝子発現解析系を構築した。ACTPK1遺伝子5'上流域-緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子融合コンストラクトまたは同遺伝子5'上流域-ルシフェラーゼレポーター遺伝子融合コンストラクトを、イネ培養細胞プロトプラストにポリエチレングリコール法により導入後、アンモニウム処理して、共焦点レーザー顕微鏡解析またはルシフェラーゼ活性測定を行った。その結果、同遺伝子5'上流域のアンモニウム濃度依存的な発現応答を確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度までに、充足濃度アンモニウム供給イネ幼植物根では、ACTPK1が高蓄積し、ACTPK1がHATS構成アンモニウム輸送体1;2 (AMT1;2)のC末端側の453番目のスレオニン残基をリン酸化して、AMT1;2を不活性化することや、このリン酸化活性に影響を与える低分子代謝産物を見いだした。また、イネ培養細胞プロトプラストでの一過的なアンモニウム応答遺伝子発現系を構築し、ACTPK1遺伝子5'上流域-レポーター遺伝子のアンモニウム濃度応答性を確認できた。イネの根における高親和性アンモニウム輸送体の翻訳後制御の分子機構の一端を解明できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、イネ根由来の培養細胞のプロトプラストでの一過的なアンモニウム応答遺伝子発現解析系を構築できた。そこで、次年度は、この解析系を用いて、ACTPK1と AMT1;2の相互作用のアンモニウム濃度依存性と相互作用部位の解析を行う。ACTPK1は、推定低分子結合・機能制御ACTドメインを含むN末端側の推定調節領域とC末端側のタンパク質リン酸化酵素ドメイン領域から構成される。野生型及びこれらの領域を部分欠損させた変異型のACTPK1の蛍光タンパク質再構成法(BiFC)コンストラクトとAMT1;2 BiFCコンストラクトを、低濃度から充足濃度のアンモニウム供給下のイネ培養細胞プロトプラストで一過的に共発現させ、原形質膜上での相互作用を共焦点レーザー顕微鏡解析する。さらに、今年度に続き、イネ根におけるACTPK1遺伝子の充足濃度アンモニウム供給応答発現機構を解析する。先ず、ACTPK1遺伝子5'上流域部分欠失DNA断片融合レポーター遺伝子の低濃度から充足濃度のアンモニウム供給下のイネ培養細胞プロトプラストでの一過的発現解析系で、充足濃度アンモニウム供給応答制御シス配列候補を探索する。同系での候補シス配列の機能欠損・最小プロモーター機能付加解析でシス配列を同定する。また、低・充足濃度アンモニウム供給下のイネ根のトランスクリプトーム比較解析または充足濃度アンモニウム供給下イネ根cDNAライブラリーの酵母One-Hybrid 法選抜により、同定シス配列と相互作用するタンパク質候補を選抜する。大腸菌内発現・精製相互作用タンパク質候補を用いたゲルシフト解析により、相互作用タンパク質を同定する。
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