| 研究課題/領域番号 |
17H03789
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
正木 春彦 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任研究員 (50134515)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 大腸菌 / バクテリア / コロニー形成 / 不飽和脂肪酸 / VBNC / cAMP / コリシンD / 硫黄代謝 |
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| 研究実績の概要 |
長くバクテリアの生死は，寒天培地上のコロニー形成能で定義されてきたが，近年天然のバクテリアは生きていてもコロニーを作らない状態にあることが知られ，改めて生物現象としてコロニー形成を理解する必要が生じた。
(1)コロニーを作らない変異株：大腸菌の不飽和脂肪酸合成の鍵酵素FabBの変異株が液体培養に比して固体培養での増殖が劣る発見を糸口に，コロニー形成における脂肪酸供給の重要性を見出した。脂肪酸合成を薬剤で抑えた時の大腸菌野生株や他の細菌の挙動を解析し，更に天然で飢餓状態にある土壌抽出液中の不特定細菌のコロニー形成への脂肪酸の添加効果を調べて，不飽和脂肪酸が天然のバクテリアのコロニー形成制限因子の１つであると結論した。
(2)低温飢餓でコロニー形成数が低下する原因遺伝子：飢餓ストレス時にコロニー形成頻度が低下していく原因として，コロニー形成に必要な生理機能が減弱する以外に、積極的にコロニー形成能を抑制する新規機構が存在し，そのスイッチがcAMP-CRPであることを見出した。cAMP-CRPが転写因子として作用する標的遺伝子をRNA-Seqで探索するデータを用い，単一細胞ラマンスペクトルをトランスクリプトームと結びつける新技術の開発に貢献した。
(3) 静菌的にコロニー形成を抑えるトキシンの研究：大腸菌表面の受容体に結合した後プロセスされて細胞内に侵入し，tRNA(Arg)を切断してタンパク質合成を止め，細胞を静菌状態にするコリシンDのX線結晶構造を決定し，分子全体の構造と機能との関連を議論した。
(4) 高発現により低温飢餓処理してもコロニー形成能を失わない遺伝子の発現で影響を受ける標的を探す過程で，硫黄代謝関連遺伝子を欠損すると低温飢餓に曝してもコロニー形成能がほとんど失われないことを発見した。その欠損がコロニー形成頻度を下げなくなる原因と硫黄代謝との関係を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画申請時に曖昧だった可能性を掘り下げて新しい結論が得られているが，脂肪酸の分散媒としてメチルサイクロデキストリン（ｍCD）を用いる計画が依然遅れている。コロニー形成因子としての脂肪酸に関してデータを取り直し，大腸菌変異体での現象を，脂肪酸供給が抑制されたバクテリアに一般化できた。とくに飢餓状態にある土壌抽出液中の不特定細菌のコロニー形成数が不飽和脂肪酸の添加で上昇する結果は高効率分離に利する手法である。しかし脂肪酸分散媒として界面活性剤を用いると菌種により生育阻害する可能性が考えられ，代替として脂肪酸をmCDに包接分散させる手法の開発は不十分である。
大腸菌の飢餓応答として，cAMP-CRPがコロニー形成数を積極的に低下させるVBNC過程のスイッチであることは判明したが，まだcAMP-CRPの標的遺伝子が同定できていない。この現象はコロニー形成能というよりも増殖能を遮断する機構だと考えている。これに類似した現象を新たに，硫黄代謝の調節遺伝子欠損で硫黄代謝の色々なステップが相対的に不十分となった場合に，増殖活性が低下するとともに，逆にcAMP-CRP欠損の場合と同様に低温飢餓条件に曝してもコロニー形成能が減衰しなくなることを見出した。しかしどのステップが直接の原因であるかはまだ押さえられていない。また硫黄代謝の下流で影響を受けうる遺伝子を探す過程で，リポ酸合成系の不全でもcAMP-CRP欠損の場合と同様に，低温飢餓ストレスでもコロニー形成能が減弱しなくなった。ただしこの現象はリポ酸添加で野生型表現型に戻るが，硫黄代謝の調節遺伝子欠損による現象は野生型に戻らないので，これらの遺伝子は直列の関係にはない。
本年は新型ウイルス流行もありほぼ4ヶ月間実験が影響を受け，最終年度のまとめが苦しくなっているのは現実である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 脂肪酸のコロニー促進効果：脂肪酸分散媒として界面活性剤を使用すると、一部の細菌のコロニー形成に影響を及ぼす可能性が考えられる。界面活性剤に対する各種細菌のコロニー感受性を再検討し、mCDを候補に加えて最適の脂肪酸の分散媒を求める。その条件下で、各種飽和・不飽和脂肪酸及び分岐鎖脂肪酸を用い、大腸菌、枯草菌、コリネバクテリウム、不特定土壌細菌に対するコロニー形成促進効果を評価する。その過程で、脂肪酸添加によって増えるコロニーが、天然の脂肪酸要求株ではないことを確認する。
2. cAMPの制御の下流にあって低温飢餓条件でコロニー形成能を遮断する遺伝子の探索：cAMPの存否で転写量が大きく変化する多数の候補遺伝子のうち、既に調べたもの以外の遺伝子について、遺伝子の欠失あるいは高発現によって低温飢餓下でもコロニー形成率の落ちない株として、cAMP-CRPの標的遺伝子を探索する。
3. コロニー形成遮断機構の全体像：改めてのスクリーニングには時間がかかるのでいままでの各種スクリーニングの結果を再検討して，ストレス応答としての増殖能遮断機構の実体に迫る。とくにcAMPによる負の制御以外，何度も候補が登場した脂肪酸代謝，硫黄代謝，PTS糖代謝，1炭素化合物代謝，中央代謝の結節点を中心に増殖能制御機構を探る。
4. 最終的に，ストレス下でバクテリアのコロニー形成数の減弱する主原因を明らかにして，高効率な検出・分離のための提案を行う。
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