きのこ類における栄養成長から生殖成長への切換えに関わる分子スイッチの特定

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H03798
• 研究機関: 公益財団法人岩手生物工学研究センター
• 研究代表者: 坂本 裕一 公益財団法人岩手生物工学研究センター, 生物資源研究部, 主任研究員 (80390889)
• 研究分担者: 石井 一夫 久留米大学, 久留米大学バイオ統計センター, 准教授 (60449238) ; 刑部 敬史 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 教授 (70450335) ; 山田 秀俊 公益財団法人岩手生物工学研究センター, 生物資源研究部, 主任研究員 (70511955) ; 中沢 威人 京都大学, 農学研究科, 助教 (80608141)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: ウシグソヒトヨタケ / 子実体 / 光受容体 / 脂質 / ゲノム編集

研究実績の概要

光照射1時間後に急激に発現が上昇する遺伝子（fas1, cfs1, cfs2, nod1) のゲノム編集による変異株を作成し、表現型を解析した結果、cfs1ゲノム編集変異株（cfs1-3)のみ光照射によるknot形成が抑制された。光照射後6時間後以降に発現が上昇する遺伝子（lcc1, phe, fccm2)の変異株を作成したところ、fccm2変異株では、knotは形成後の子実体への成長が抑制された。光受容体であるdst1, dst2, wc2についてゲノム編集による変異株を作出したところ、全て同調的なknot形成が抑制された。それらの変異株では全てfas1, cfs1, cfs2の発現が抑制された。knot形成に必須な遺伝子及び、それらの制御に関わる光受容体について、重要な知見が得られた。
fas1遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼ（luc)遺伝子をつなぎ、菌糸に光を照射することでルシフェラーゼ発光が検出できる系を確立した。プロモーターデリーションアッセイを行なったところ、fas1遺伝子の発現を抑制している領域があることが示唆された。光照射によるfas1遺伝子の発現制御機構の解明を進めることができる系を構築できたと考えられる。
脂質修飾酵素であるcfs1遺伝子の変異株でknot形成が抑制されたことから、cfs1変異株と野生株との脂質の比較を行った。その結果両者では脂質組成に大きな差があることが明らかになり、knot形成機構の解明に向けて重要な知見が得られた。
knot形成領域におけるRNA-seqデータの取得を行なった。knot形成領域、knot形成領域より外側、内側及び光照射後のknot形成領域でのRNA-seqリードの取得が完了した。光照射後のデータの解析から、既知のfas1等の発現が上昇することが確認されている。このことから信頼性の高いデータが得られたと考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

申請書において、今年度実施する予定であったゲノム編集実験が予定以上に進捗するとともに、変異株の中かからそれぞれknot形成及びknotの成長に必須な遺伝子が明らかになったことから、この内容については予定以上の進捗が得られたと考えられる。また、既知光受容体についてもゲノム編集株が得られ、それぞれ光照射による同調的なknot形成への影響が確認できたことから、予定以上の進捗があったと考えられる。さらに、未知の光受容体候補であるcryAについても光照射で発現が上昇すること、及び既知光受容体変異株において発現が抑制されるという新規知見を得た。
予定していたオミクス解析については、RNA-seqデータについては予定通り解析データを取得できた。また、脂質のデータについても一定のデータを得ることができた。重要な実験計画内容については概ね順調に進んでいると考えられる。一方核内タンパク質のプロテオーム解析については、今年度行うことができず、次年度に持ち越しとなったことから、やや進捗に遅れが生じている。
光照射によるfas1遺伝子の発現制御機構の解明については、今年度予定していたfas1-lucの系が確立できた。さらに、プロモーターのデリーションアッセイより光照射誘導がかかるまで強力に発現を抑制していると考えられる領域が推定されたことから、予定以上の進捗が得られたと考えらえる。
全体を通して、やや進捗に遅れが生じた計画もあったが、それ以上に進捗している計画もあることから、全体としては概ね順調であると判断した。

今後の研究の推進方策

H30年度には、RNA-seqデータを解析することにより、光照射前に子実体発生領域で特異的に発現する遺伝子を特定する（坂本、石井）。 子実体発生時期に核内移行する転写因子を特定するために、核内タンパク質のプロテオーム解析を進める。リン酸化を介したシグナル伝達経路が機能しているかどうか確認するために、リン酸化タンパク質のプロテーム解析を行う（坂本）。 上記で特定された遺伝子をゲノム編集により破壊し表現型を解析することで、同調的な子実体発生に必須な遺伝子を特定する（坂本、刑部）。
2.　 H30年度はcryAの破壊株を作成し、その表現型を解析する（坂本、刑部）。H29年度に、光照射すると発現が急上昇するfas1遺伝子にルシフェラーゼ（luc)をつないで、光照射することで発光する系を確立した（fas-luc)。H30年は、fas-luc株を用いてシスエレメントを同定するとともに、One-hybrid法を用いて、結合するタンパク質を特定する。また、fas-luc株の変異株を作成し、光照射によるluc発光が消失した菌株を選抜する（坂本、中沢） 。
3.　植物無細胞タンパク質合成システムを用い、CFS1タンパク質を合成し、活性を確認する。cfs1ゲノム編集株と野生株での脂質を比較し、cfs1株で有意に少ない脂質を明らかにすることで、CFS1タンパク質が生産する脂質を特定する（坂本、山田）。野生株に光を照射した時に産生される脂質をcfs1ゲノム編集株に添加することで、子実体発生を誘導できるか確認する。以上により、子実体発生誘導に関わる脂質を特定する。脂質添加により遺伝子発現が制御される機構を明らかにする目的で、子実体発生時に特異的に発現する遺伝子プロモーターにlucを結合させ、脂質添加でluc発光が誘導される系の確立を進める（坂本、中沢）。

研究成果

• [学会発表] ウシグソヒトヨタケにおける子実体発生制御に関わる遺伝子の特定 (2017)
  • 著者名/発表者名: 坂本裕一，佐藤志穂，村口元，中沢威人，刑部敬史
  • 学会等名: 糸状菌分子生物学コンファレンス