| 研究課題/領域番号 |
17H03808
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
亀山 昭彦 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 上級主任研究員 (80415661)
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| 研究分担者 |
佐藤 隆 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (90371046)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | グライコミクス / 糖転移酵素 / 糖鎖 |
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| 研究実績の概要 |
腫瘍や幹細胞などの新規マーカー探索および感染や免疫反応の分子病理学的解明において、迅速簡便な糖鎖解析技術であるグライコミクスは必須の技術となりつつある。しかしながら現在のグライコミクスは主にN-型型糖鎖を対象としており、もう一つの糖鎖種であるO-型糖鎖の分析については40年以上進歩しておらず新たな技術革新が切望されている。最近、研究代表者はO-型糖鎖の新規遊離法を発見し、従来より格段に微量な分離検出を可能とした。これをグライコミクスへ応用するためには分離したO-型糖鎖の簡便な同定法の開発が必須である。そこで本研究では、O-結合型糖鎖の大規模ライブラリーを作成し、HPLC, CEおよびタンデム質量分析における各糖鎖の分析固有値を蓄積して糖鎖同定のための新たなグライコミクスの技術基盤を構築することを目的としている。
平成29年度は、フェツイン、ウシ顎下腺ムチンおよびブタ胃ムチンからO-型糖鎖を遊離後、蛍光標識した後、HPLCにて分取、質量分析計にて構造を確認し、20種類のO-型糖鎖ライブラリーを構築した。さらに、各種糖転移酵素を用いたO-型糖鎖合成を行いライブラリー化するため、ライブラリーの基幹構造の合成に必要なβ4ガラクトース転移酵素およびβ3ガラクトース転移酵素を調製した。具体的には、産総研ヒト糖鎖遺伝子ライブラリーを利用して、酵素活性領域を発現ベクターに組換え、ヒト培養細胞で可溶性酵素として発現させたものをビーズに固定化した。また、ライブラリー合成のための基質としてN末端をFmoc化したコア4（GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc）スレオニンを調製した。これを基質とすることにより酵素反応生成物を蛍光検出によりHPLCで分取することが容易になる。このFmocスレオニン糖鎖と糖転移酵素固定ビーズを用いたO-型糖鎖の合成検討を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
市販糖タンパク質からのO型糖鎖ライブラリーの構築、糖転移酵素の調製、糖アミノ酸を基質とした糖鎖アミノ酸の酵素合成など、ほぼ計画どおりに進捗している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、O-型糖鎖ライブラリーの充実を図るとともに、ライブラリー内の各O-型糖鎖についてキャピラリー電気泳動による固有値の取得を開始する。具体的な実施計画は以下の通り。
①各種リコンビナント糖転移酵素の調製：産総研ヒト糖鎖遺伝子ライブラリーを利用して、O-型糖鎖の伸長に必要な各種糖転移酵素の酵素活性領域を発現ベクターに組換え、ヒト培養細胞で可溶性酵素として発現させる。②ムチン型母核（コア１～コア４）スレオニンを出発原料とするライブラリー作成：各ムチン型母核-スレオニンのN末端にFmoc基を導入し、さらに糖鎖を各種糖転移酵素により伸長していく。伸長させた糖鎖はHPLCで分取、質量分析計にて構造を確認後、ムチン型糖鎖スレオニンライブラリーとして蓄積する。③ムチン型糖鎖スレオニンライブラリーからO-型糖鎖ライブラリーへの変換：糖アミノ酸から糖鎖を遊離するマイルドな反応条件を最適化する。遊離された糖鎖を2-AA標識し精製することにより、O-型糖鎖ライブラリーを蓄積する。④O-型糖鎖ライブラリーのキャピラリー電気泳動：ホウ酸緩衝液に溶解したポリエチレングリコールを用いるキャピラリーゲル電気泳動にて、各種O-型糖鎖を分析する。この際、内部標準を試料に添加し分析毎の泳動時間のシフトを補正する。複数の糖鎖で極めて類似した泳動データが得られた場合には、別の分離モードでの分離を検討する。
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