| 研究課題/領域番号 |
17H03923
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
永岡 謙太郎 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60376564)
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| 研究分担者 |
藤田 知之 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (00419392)
金蔵 孝介 東京医科大学, 医学部, 講師 (10508568)
伊藤 昌彦 浜松医科大学, 医学部, 助教 (50385423)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 乳癌 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、乳腺上皮細胞と乳癌細胞における細胞質ポリアデニル化複合体機能の相違点を解明し、複合体を正常に機能させる制御メカニズムを明らかにすることで、乳癌の発生と進行を抑える創薬開発につなげることを目的としている。以下、３つの実施項目ごとに今年度の実績を報告する。
１）「正常乳腺細胞と乳癌細胞における複合体機能の相違点」については、各サブタイプの乳癌細胞株と正常乳腺上皮細胞より細胞ライセートの作成を行い、現在、複合体構成タンパクのプロファイリングを実行中である。RNAの解析についても、Thermal elution法を用いてポリA鎖の長さによりmRNAの分画を行った。次年度に、「ポリA鎖RNA-seqデータベース」と「翻訳活性プロテオーム・データベース」を完成させる。
２）「CPEB1（およびPARN）発現制御メカニズム ー発現解析―」については、これまでにヒト臨床サンプル２４検体を用い、CPEB1とPARN遺伝子の発現解析を行った結果、正常部ではCPEB1発現が高く、癌部ではPARN発現が高いことをmRNAレベルで明らかにした。現在、染色によるタンパク発現と局在を解析中である。また、乳癌細胞を用いた解析により、CPEB1発現はエストロゲンにより抑制され、プロゲステロンにより刺激される結果が得られている。犬および、猫の乳腺腫瘍サンプルについては、現在、約40検体のサンプルが集まり、次年度に解析を予定している。
３）「CPEB1（およびPARN）発現制御メカニズム ースクリーニング―」については、CPEB1およびPARNプロモーター領域（上流２kb）をNanoLuc発現プラスミドに挿入したコンストラクトの作成が完了し、MCF7細胞にCMVプロモーターで制御されるホタルルシフェラーゼとCPEB1-NanoLuc、およびPARN-NanoLucを定常発現させた細胞を作製中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究項目「正常乳腺細胞と乳癌細胞における複合体機能の相違点」に若干の遅れがあると思われる。当初の計画では、タンパク翻訳活性の評価と「翻訳活性プロテオーム・データベース」の構築にポリソームプロファイリングとiTRAQ解析の組み合わせを予定していたが、現在、新しい解析方法としてリボソームプロファイリングが主流となりつつある。本研究についても、リボゾームプロファイリング法を導入すべく準備を進めており、次年度に実施する予定でいる。「ポリA鎖RNA-seqデータベース」については順調に進んでいる。
研究項目「CPEB1（およびPARN）発現制御メカニズム ー発現解析―」において、ヒトおよび犬猫の臨床サンプルの収集が順調に進んでいる。少なくともヒトにおいてはこれまでの仮説に基づき、正常乳腺組織にはCPEB1遺伝子が高発現しているが、癌組織ではPARN遺伝子が高くなる結果が得られている。また、研究項目「CPEB1（およびPARN）発現制御メカニズム ースクリーニング―」のCPEB1およびPARN遺伝子の上流域解析、低分子化合物スクリーニング用のコンストラクト作成と定常発現細胞の作製も進み、実際に行うその他実験系の準備もほぼ終了しているため、次年度には本解析を完了することが可能である。
研究項目「他の上皮悪性腫瘍における複合体機能の重要性」については引き続き、乳癌以外の上皮悪性腫瘍の細胞株の収集に努める
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| 今後の研究の推進方策 |
基本的には前年度に引き続き解析を実施する
研究項目「正常乳腺細胞と乳癌細胞における複合体機能の相違点」については「ポリA鎖RNA-seqデータベース」と「翻訳活性プロテオーム・データベース」を完成させ、正常乳腺細胞および各サブタイプ乳癌細胞においてmRNAのポリA鎖の長さと翻訳活性レベルが連動する因子を抽出する。
研究項目「CPEB1（およびPARN）発現制御メカニズム ー発現解析―」についてはヒトと同様に犬と猫の乳癌組織の遺伝子解析を終了させ、CPEB1とPARN遺伝子変化のヒトと犬猫の同一性を確認する。また、乳癌細胞に対するホルモンの作用機序についても解析を続け、ホルモンとCPEB1およびPARN遺伝子発現との関連性と細胞のがん化や転移能について詳細な検討を行う。
研究項目「CPEB1（およびPARN）発現制御メカニズム ースクリーニング―」については、予定通り低分子化合物スクリーニングを実施し、両遺伝子発現に関与する化合物を探索する。また、Genome-wide CRISPR スクリーニングの実施準備を開始する。
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