| 研究課題/領域番号 |
17H03931
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
松脇 貴志 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (20447361)
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| 研究分担者 |
角田 茂 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (80345032)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | GnRH / プロスタグランジン / LHパルス / GCaMP |
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| 研究実績の概要 |
１． GnRHプロモーターの下流にGFP遺伝子を組み込まれた配列を導入されたラットを実験に用いた。このトランスジェニックラットはGnRHニューロン特異的にGFPを発現する。このラットの視索前野領域にプローブを刺入し、蛍光顕微鏡によって生きたラットの脳内でGnRHニューロンを蛍光観察することに成功した。
２．アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて視索前野領域にGCaMP（カルシウム依存性緑色タンパク質）の遺伝子導入を行い、２週間後に脳を採取した。この脳を免疫染色に供し、視索前野にてGCaMPタンパク質が発現していることを確認した。さらに、同部位に生体観察用のレンズを埋め込み、２週間の回復期間を置いたのちプローブに接続して、生きたラットの脳深部においてGCaMPの蛍光を検出した。
3. 頸静脈にカニューレを留置したラットから５分毎3時間の連続採血を行い、得られた血液中の黄体形成ホルモン（luteinizing hormone, LH）濃度を測定することで、LHパルスを観察した。我々はこれまでの研究で、菌毒素Lipopolysaccharide （LPS）によるLHパルス抑制をプロスタグランジン（PG）E2とPGF2α によるLHパルスが仲介するという仮説を構築した。これを検証するため、本研究ではLHパルス観察下でLPSと同時にPGF2αの受容体拮抗薬の脳室内投与を行なった。しかしこの拮抗薬ではLPSによるLHパルス抑制は阻害されなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定していたGnRHニューロン特異的にCreを発現するKnock-inラットにAAVベクターを用いてCre依存的に発現するGCaMP遺伝子を導入するという実験に加え、GnRHニューロン特異的にGFPを発現しているラットのGnRHニューロン分布領域にAAVベクターでRCaMP（カルシウム依存性赤色タンパク質）を発現させる実験を進めている。後者のGnRH-GFPラットではプローブ型の顕微鏡により麻酔下のラットでGnRHニューロンの像が非常に明瞭に得られている。さらに遺伝子を導入したRCaMPのタンパク質が標的領域に発現していることも確認できたため、現在両蛍光像を重ね合わせてみることで活性化状態にあるGnRHニューロンの同定を試みている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 上記の GnRH-Cre + AAV-GCaMPおよびGnRH-GFP + AAV-RCaMPという二種類のラットを用いて、GnRHパルス／サージのin vivo 蛍光観察系の確立を目指す。
2. この系を使い、PGE2やPGF2αを脳室内投与することでこれらのPG類がGnRHの分泌様式に与える影響を解析する。
3. PGE2やPGF2αの合成酵素発現のRNAiによる阻害がLPS依存性のLHパルス抑制に与える影響を観察する。
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