| 研究課題/領域番号 |
17H03944
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
小林 淳 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (70242930)
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| 研究分担者 |
東 政明 鳥取大学, 農学部, 教授 (20175871)
伊藤 雅信 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 教授 (60221082)
森 肇 京都工芸繊維大学, その他部局等, 副学長 (80201812)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 中腸幹細胞 / カイコ / Bacillus thuringiensis / Cry毒素 / 昆虫病原ウイルス |
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| 研究実績の概要 |
１．各種昆虫中腸幹細胞培養技術の開発・改良
（１）カイコ：４眠幼虫だけでなく，化蛹当日（white pupa～light brown pupaのステージ）からも形状的に同様な幹細胞を得られることがわかった（70～90万細胞／5個体）．Heliothis virescens で使用されている AlbuMax II（Lipid-rich bovine serum albumin）を Grace medium 中へ１～２％ 添加すると分裂が促進され，これまで１週間でほぼ死滅していた幹細胞が，１週間で 10% 程度は生存（残存）するように改善されたが，分化誘導は認められなかった．一方，FBSを培地へ10% となるように添加したが，改善は認められなかった．（２）野蚕：カイコと同様の方法でエリサン4眠幼虫の中腸幹細胞の培養を試みたが，すぐに死滅してしまったため，最適な分離・培養条件がカイコとは異なると判断された．
２．培養中腸細胞の病理学研究への応用
（１）BTのCry毒素の作用メカニズムの解析：ハエ目昆虫に対して殺虫活性を示すCry毒素（Cry11Aa及びCry4Aa）タンパク質を内包化したタンパク質微結晶（Cry11Aa多角体、Cry4Aa多角体）を作製し，カイコガ幼虫に摂食させたところ殺虫活性を示さなかったが，ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）の幼虫に対しては強い殺虫活性を示した。そこで、チョウ目昆虫に対して殺虫活性を示すCry1laを内包化した多角体（Cry1la多角体）の作製に着手した．（２）各種昆虫病原ウイルス感受性解析：開発途中のカイコ中腸幹細胞培養系にBmNPV野生株あるいはGFP発現組換えウイルスのBVを感染させたが，多角体の形成あるいはGFP蛍光が見られず，中腸幹細胞ではポリヘドリンプロモーターの転写活性またはBVの感染効率が低い可能性が示唆された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
分担研究者の東が開発したカイコ中腸幹細胞培養系作製の基本プロトコールの改善が進展する一方，研究代表者の小林への技術移転が完了し，エリサン中腸幹細胞培養系作製に応用する段階まで到達することができた．また，BT毒素のプロテインチップの作製も順調に進展しており，今後，生理学および病理学的な応用にむけた基盤技術が整いつつある．なお，培養条件あるいはウイルス感染条件などがまだ最適化できていないが，そもそも前例のない技術開発だけに，試行錯誤による若干の研究計画スケジュールの遅れは想定内といえる．
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| 今後の研究の推進方策 |
１．各種昆虫中腸幹細胞培養技術の開発・改良（１）カイコ：平成29年度の継続となるが，AlbuMax II試薬の添加が幹細胞の分裂促進に有効であることを示唆する結果が得られたので，さらに最適な増殖条件を検討し，安定な幹細胞維持が可能になれば，その単独浮遊性の細胞から，本来の中腸上皮細胞（円筒細胞・杯状細胞）への誘導分化を試験する．（２）野蚕：平成29年度に着手したエリサンの中腸培養系作製技術のさらなる改良・最適化を実施する．
２．培養中腸細胞の生理学研究への応用（１）分泌機能および輸送機能の解析：中腸機能（円筒細胞や杯状細胞への分化）を検定するために，細胞タイプ特異的なチャ ネルタンパク質（円筒細胞で特異的に発現する水チャネル（アクアポリン）など）細胞タイプ特異的なマーカーを使って分化途上を追跡する．（２）機能分化に伴う遺伝子発現制御の解析：Cry毒素のレセプターの有力な候補であるアルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現を，カイコ中腸の幹細胞，円筒細胞，杯状細胞で比較し，分化にともなう2種類のアルカリ性ホスファターゼの発現変動の様態を明らかにする．
３．培養中腸細胞の病理学研究への応用（１）BTのCry毒素の作用メカニズムの解析：平成29年度に引き続き、活性型Cry毒素ペプチドを内包化した多角体をプロテインチップとして用いることで，活性型Cry毒素ペプチドと結合した細胞の変化を詳細に解析する．（２）各種昆虫病原ウイルス感受性解析：平成29年度に引き続き，カイコ中腸培養分化系を用いて，カイコ核多角体病ウイルスBmNPV，カイコ細胞質多角体病ウイルスBmCPVおよび濃核病ウイルスBmDNV-1 および-2の感受性解析を続行し，従来の樹立培養細胞株における各種ウイルスの感受性および感染細胞における症状の違いなどを比較検討し，組織特異的な感染実験系としての有効性を検証する．
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