| 研究課題/領域番号 |
17H03944
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
小林 淳 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (70242930)
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| 研究分担者 |
東 政明 鳥取大学, 農学部, 教授 (20175871)
伊藤 雅信 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 教授 (60221082)
森 肇 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 教授 (80201812)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 中腸幹細胞 / カイコ / Bacillus thuringiensis / Cry毒素 / 昆虫病原ウイルス |
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| 研究実績の概要 |
１．各種昆虫中腸幹細胞培養技術の開発・改良
（１）カイコ：4眠幼虫および蛹から調製した中腸幹細胞を冷蔵保管すると，3週間後でも比較的多くの細胞が生存維持されることが判明した．また，1週間冷蔵した幹細胞を25℃で培養再開すると，細胞が集塊を形成し，中腸上皮細胞への分化が促進される可能性が示唆された．さらに，蛹化直後の蛹成分を培地に 添加すると，増殖分裂が促進される傾向が認められた．（２）野蚕：エリサン4眠幼虫および蛹の中腸幹細胞の分離回収効率の改善に成功した．また，回収直後の幹細胞からRNAを抽出し，中腸特異的な発現が知られている数種の遺伝子に対するプライマーを用いてRT-PCR分析を行ったところ，分化した中腸上皮細胞と同様の発現が認められた．
２．培養中腸細胞の病理学研究への応用
（１）BTのCry毒素の作用メカニズムの解析：Bacillus thuringiensis のCry毒素（Cry4Aa およびCry11Aa）を内包化した多角体を，キイロショウジョウバエ胚由来および翅原基由来培養細胞に与えた結果，細胞の形状や増殖に異常はみられなかった．また，同量の多角体をキイロショウジョウバエ成虫の餌に添加した結果，致死性は認められず，F1世代の生育にも影響が見られなかった．一方，チョウ目昆虫，特にカイコガ幼虫に対して強い殺虫活性を示すCry1Laを内包化した多角体を作製し，カイコ3齢幼虫に経口投与した結果，非常に強い殺虫効果を示し，投与後2時間以内に幼虫は苦悶し，吐液するなど典型的な症状を示した．このCry1Laはプレ体の状態で多角体に内包化しているが，経口摂取された多角体は幼虫の消化管内で溶解し，さらにタンパク質分解酵素（トリプシン）で切断され，活性体になったものと考えられた．（２）各種昆虫病原ウイルス感受性解析：中腸幹細胞培養系の開発・改良を優先し，実施を見合わせた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
分担研究者の東によるカイコ中腸幹細胞培養系作製の基本プロトコールのさらなる改善および維持と分化誘導に役立つ新技術が開発され，研究代表者の小林においてもエリサン中腸幹細胞培養系作製技術の改善と遺伝子発現レベルでの特性解析が進展している．また，BT毒素のプロテインチップの作製は計画通り進展しており，今後，生理学および病理学的な応用にむけた基盤技術が整いつつある．なお，培養条件あるいはウイルス感染条件などがまだ最適化できていないが，そもそも前例のない技術開発だけに，試行錯誤による若干の研究計画スケジュールの遅れは想定内といえる．
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| 今後の研究の推進方策 |
１．各種昆虫中腸幹細胞培養技術の開発・改良（１）カイコ：中腸幹細胞の分化誘導条件の検討ならびに実験系としての冷蔵保存技術の確立を行う．（２）野蚕：エリサンの中腸培養系のさらなる改良・最適化を進めるとともに，RNA-seqによる網羅的遺伝子発現特性解析を行う．
２．培養中腸細胞の生理学研究への応用（１）分泌機能および輸送機能の解析：円筒細胞や杯状細胞への分化誘導を検定するために，細胞タイプ特異的なチャネルタンパク質（円筒細胞で特異的に発現する水チャネル（アクアポリン）など）細胞タイプ特異的なマーカーを使って分化途上を追跡する．（２）機能分化に伴う遺伝子発現制御の解析：Cry毒素のレセプターの有力な候補であるアルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現を，カイコ中腸の幹細胞，円筒細胞，杯状細胞で比較し，分化にともなう2種類のアルカリ性ホスファターゼの発現変動の様態を明らかにする．
３．培養中腸細胞の病理学研究への応用（１）BTのCry毒素の作用メカニズムの解析：多角体に内包化したCry1Laを培養細胞系に与える際の条件検討，具体的には多角体の溶解条件，トリプシン処理の条件を検討し、活性型Cry1Laの細胞への結合，細胞病変効果などを詳細に調べる．また，多角体の量などの条件を検討するとともに，ショウジョウバエ幼虫を用いた影響調査を行う．さらにキイロショウジョウバエの遺伝子ノックアウト系統を用いて，Cry毒素受容体タンパクの探索を行う．（２）各種昆虫病原ウイルス感受性解析：今年度中断していた実験を再開し，カイコ中腸培養分化系を用いて，まずは，カイコ核多角体病ウイルスBmNPVの感受性解析を続行し，従来の樹立培養細胞株におけるウイルスの感受性および感染細胞における症状の違いなどを比較検討し，組織特異的な感染実験系としての有効性を検証する．
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