電位センサーを標的とした電位依存性イオンチャネルの機能制御と創薬戦略の構築

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H03978
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 大澤 匡範 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (60361606)
• 研究分担者: 横川 真梨子 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 助教 (60648020)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: VGIC / Gating Modifier Toxin / voltage sensing domain / NMR / interaction

研究実績の概要

電位依存性イオンチャネル(voltage-gated ion channel, VGIC)は、膜電位に応じた特定イオンの膜透過を通じて膜電位を制御し、神経伝達や心臓の拍動を担う膜タンパク質であり、創薬の標的としても重要である。VGIC は、膜電位に応じた電位センサードメイン(VSD) の構造変化が、ポアドメインのイオン透過路を開閉し、イオンを膜透過させる。本研究では、以下の4 点を通じて、VSDに結合してVGIC の機能を調節するリガンドの作用機序を解明し、VSD を新規創薬標的とする創薬戦略を確立することを目的とする。(1)各リガンドが結合するVSD の機能構造の同定、(2)VSD上の結合部位、結合に伴う構造変化部位、結合様式の構造生物学的解明、(3) VSD の機能構造選択的に結合する新規リガンドの探索、(4)VSD の機能構造選択的な創薬戦略の実現可能性の実証。
これまでにVGICの中で、不整脈に関わるhERG、精子受精能・異物貪食に関わるHv1、構造生物学的解析が進んでいるKvAP について、VSD（KvAP についてはVSD と全長）の大量調製法を確立した。hERGについては、VSDに特異的に結合するGating Modifier ToxinであるAPETx1のrefoldingを伴う大量調製法を確立し、NMRシグナルの帰属を確立するとともに、NMRによりVSDとGMTの直接の相互作用の検出に成功した。また、パッチクランプ実験により、APETx1のhERG阻害活性を確認した。Hv1については、活性化リガンドであるアラキドン酸との相互作用を等温滴定型カロリメトリーで解析する手法を確立した。また、阻害リガンドであるHaTx1の大量調製法の確立を試みている。KvAP-VSDについては、SS-lockingで機能構造を安定化した変異体を大量調製し、結晶化を試みている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

最大の難関であった試料の大量調製法の確立については、hERG-VSD, Hv1, KvAP-VSD, APETx1について、計画通り進捗した。また、相互作用に関しては、APETx1のhERG阻害活性を確認したこと、hERG-VSDとの相互作用をNMRで検出したこと、 Hv1とアラキドン酸との相互作用解析法を確立できたことなど、概ね計画通りであり、順調に進行している。

今後の研究の推進方策

まだ、試料調製法の確立できていない、Hv1阻害toxinであるHaTx1の大量調製法を確立し、Hv1の活性に対する影響を評価する。大量調製法を確立し、相互作用も検出できた系については、X線結晶構造解析およびNMRにより、複合体構造を原子レベルで明らかにする。
大量発現が困難なhERG全長などは、酵母での発現を試みる。

研究成果

• [雑誌論文] Structural basis for the ethanol action on G-protein-activated inwardly rectifying potassium channel 1 revealed by NMR spectroscopy (2018)
  • 著者名/発表者名: Yuki Toyama, Hanaho Kano, Yoko Mase, Mariko Yokogawa, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 巻: 115 ページ: 3858-3863
  • DOI: 10.1073/pnas.1722257115
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of the multimeric structure of poly(A)-binding protein on a poly(A) tail. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ryoichi Sawazaki, Shunsuke Imai, Mariko Yokogawa, Nao Hosoda, Shin-ichi Hoshino, Muneyo Mio, Kazuhiro Mio, Ichio Shimada, Masanori Osawa
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 8 ページ: 1455
  • DOI: 10.1038/s41598-018-19659-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nuclear magnetic resonance approaches for characterizing protein-protein interactions (2018)
  • 著者名/発表者名: Yuki Toyama, Yoko Mase, Hanaho Kano, Mariko Yokogawa, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • 雑誌名: Methods Mol Biol. 巻: 1684 ページ: 115-128
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-7362-0_10
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular mechanism of the ATP-dependent modulation of the Mg2+ channel MgtE for Mg2+ homeostasis (2017)
  • 著者名/発表者名: Atsuhiro Tomita, Mingfeng Zhang, Fei Jin, Wenhui Zhuang, Hironori Takeda, Tatsuro Maruyama, Masanori Osawa, Ken-ichi Hashimoto, Hisashi Kawasaki, Koichi Ito, Naoshi Dohmae, Ryuichiro Ishitani, Ichio Shimada, Zhiqiang Yan, Motoyuki Hattori, Osamu Nureki
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 8 ページ: 148
  • DOI: 10.1038/s41467-017-00082-w
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] B型肝炎ウイルスの粒子形成機構の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 横川 真梨子、石場 智彬、池田 寿子、藤田 浩平、横田 旭美、大澤 匡範
  • 学会等名: 日本薬学会 第138年会
• [学会発表] 電位依存性カリウムイオンチャネルhERGの閉状態の安定化による、hERG開閉機構の構造生物学的解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 松村 一輝、簗瀬 尚美、秋元 まどか、岩崎 菜々美、坂本 多穗、黒川 洵子、横川 真梨子、大澤 匡範
  • 学会等名: 日本薬学会 第138年会
• [学会発表] B型肝炎ウイルスの粒子形成機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 横川 真梨子、石場 智彬、池田 寿子、藤田 浩平、横田 旭美、大澤 匡範
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] ポリA上のPABP多量体による翻訳調節メカニズムの解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 沢崎 綾一、今井 駿輔、横川 真梨子、細田 直、星野 真一、三尾 和弘、三尾 宗代、嶋田 一夫、大澤 匡範
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] 電位依存性プロトンチャネルVSOP/Hv1のアラキドン酸による活性化促進機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 松葉 広昭、横川 真梨子、木村 友美、望月 綾野、川鍋 陽、岡村 康司、嶋田 一夫、大澤 匡範
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] 緩和速度の磁場依存性解析によるGタンパク質へのGDP結合の動的制御機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 外山 侑樹, 加納 花穂, 間瀬 瑶子, 横川 真梨子, 大澤 匡範, 嶋田 一夫
  • 学会等名: 第56回NMR討論会
• [学会発表] Dynamic regulation of GDP binding to G proteins revealed by magnetic field-dependent NMR relaxation analyses (2017)
  • 著者名/発表者名: Hanaho Kano, Yuki Toyama, Yoko Mase, Mariko Yokogawa, Masanori Osawa, Ichio Shimada
  • 学会等名: 2017 Taiwan-Japan Biomedical Symposium on Magnetic Resonance
  • 国際学会
• [学会発表] Gタンパク質のファミリー選択的なK+チャネル活性制御機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 加納 花穂, 外山 侑樹, 岩橋 優太, 間瀬 瑶子, 横川 真梨子, 大澤 匡範, 嶋田 一夫
  • 学会等名: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] Structure-Free化合物ライブラリー解析システムの構築と検証 (2017)
  • 著者名/発表者名: 池田和由、清水祐吾、大澤匡範
  • 学会等名: 第45回 構造活性相関シンポジウム
• [学会発表] 生物活性情報に基づく構造非開示での化合物ライブラリー多様性評価法の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 清水祐吾、池田和由、大澤匡範
  • 学会等名: 第45回 構造活性相関シンポジウム
• [学会発表] Development of Structure-free Design and Analysis for Compound Libraries Based on Chemical and Bioactive Diversity (2017)
  • 著者名/発表者名: Yugo Shimizu, Kazuyoshi Ikeda, Masanori Osawa
  • 学会等名: CBI学会
• [学会発表] カリウムチャネルのミリ秒オーダーの開閉の構造機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 岩橋 優太、外山 侑樹、今井 駿輔、大澤 匡範、嶋田 一夫
  • 学会等名: 第17回日本蛋白質科学会年会