O-マンノース型糖鎖の構造多様性とその決定機構の解明

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H03987
• 研究機関: 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所)
• 研究代表者: 萬谷 博 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究副部長 (20321870)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 糖鎖 / 神経疾患 / 筋疾患 / O-マンノース型糖鎖

研究実績の概要

O-マンノース（Man）型糖鎖には多様な構造が存在し、構造の特徴によりコアM1、コアM2、コアM3の3タイプに分類される。コアM3糖鎖の合成不全は中枢神経障害を伴う先天性筋ジストロフィー症の原因となる。我々はこれまでに、コアM3糖鎖にリビトールリン酸（RboP）が含まれることを発見し、コアM3糖鎖の構造解明と生合成酵素の同定を進めてきた。本研究では、O-Man型糖鎖合成に関わる糖転移酵素群の機能を詳細に解析することで、多様な構造の存在意義や多様な構造をつくるメカニズムの解明を目指している。本年度は、コアM3糖鎖合成においてManの6位のリン酸化を担う酵素であるPOMKの結晶構造を解析し、POMKはManをリン酸化する際に、糖受容体基質の[GalNAc-GlcNAc-Man-]の3糖を認識して結合することを明らかにした。また、コアM3糖鎖構造中の[Xyl-RboP-RboP-]を合成する糖転移酵素、fukutin、FKRP、TMEM5はリコンビナント酵素による予備的な実験からこれら三者による複合体の形成が示唆されていた。今回、内在性酵素による複合体の形成を確認した。Mycタグを融合した全長型TMEM5のみを強制発現させた細胞から、抗Mycタグ抗体でTMEM5を免疫沈降した画分に内在性のfukutin活性とFKRP活性がともに検出されたことから、TMEM5は内在性のfukutinおよびFKRPと複合体を形成することが確認された。fukutin、FKRP、TMEM5は[Xyl-RboP-RboP-]を合成する連続した反応を担うことから、複合体形成は、希少な標的に確実にかつ効率的に糖鎖を転移することに寄与していると考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

O-Man型糖鎖合成関連酵素の構造と機能の解析において、各酵素のX線結晶構造解析は順調に進捗している。平成29年度はPOMKの結晶構造を解明し基質認識機構を明らかにした。また、fukutin、FKRP、TMEM5が複合体を形成して機能することを明らかにし、重要だが希少な糖鎖合成の際に効率的に糖鎖を転移するメカニズムを示した。現在、他の酵素についてもX線結晶構造解析を順次進めている。こうした結晶構造解析による基質認識機構の解明は、O-Man型糖鎖がどのような構造の糖鎖あるいはタンパク質の上に合成されるのかを調べる上で重要であり、また、変異による疾患発症のメカニズムを理解する上で重要である。

今後の研究の推進方策

平成29年度に引き続き、計画（１）（２）を行い、平成30年度より計画（３）を開始する。
（１）O-Man型糖鎖合成関連酵素の構造と機能の解析： X線構造解析により、各酵素の基質認識機構およびドメイン構造と各ドメインの機能を解析し、疾患で見られる変異の影響について調べる。同時に生化学的手法により構造解析から得られる情報と酵素活性や疾患との関連について検討する。
（２）リビトールリン酸（RboP）およびO-Man型糖鎖修飾タンパク質の探索：RboPを含む糖鎖は、コアM3タイプのO-Man型糖鎖として哺乳類では初めて発見された。しかしこれまでにコアM3型糖鎖が修飾されるタンパク質はα-ジストログリカンしか報告されていない。そこで、RboPあるいはコアM3型糖鎖の他のタンパク質における修飾を調べる。
（３）CDP-Rboトランスポーターの同定：哺乳動物細胞では、ゴルジ体内腔においてFKTNおよびFKRPにより糖供与体のCDP-RboからRboPとしてO-マンノース型糖鎖に転移される。しかし、CDP-RboはISPDにより細胞質で合成されるため、細胞質からゴルジ内腔へ移動する必要がありトランスポーターの存在が想定される。そこで、CDP-Rboトランスポーターの同定を目指す。

研究成果

• [国際共同研究] Radboud University Medical Center(オランダ)
  • 国名: オランダ
  • 外国機関名: Radboud University Medical Center
• [国際共同研究] Peking University First Hospital/Peking Union Medical College(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: Peking University First Hospital/Peking Union Medical College
• [国際共同研究] Baylor College of Medicine(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Baylor College of Medicine
• [国際共同研究] McGill University Health Centre(カナダ)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: McGill University Health Centre
• [雑誌論文] Cell endogenous activities of fukutin and FKRP coexist with the ribitol xylosyltransferase, TMEM5 (2018)
  • 著者名/発表者名: Nishihara Ryuta、Kobayashi Kazuhiro、Imae Rieko、Tsumoto Hiroki、Manya Hiroshi、Mizuno Mamoru、Kanagawa Motoi、Endo Tamao、Toda Tatsushi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 497 ページ: 1025～1030
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.02.162
  • 査読あり
• [雑誌論文] 3D structural analysis of proteinO-mannosyl kinase, POMK, a causative gene product of dystroglycanopathy (2017)
  • 著者名/発表者名: Nagae Masamichi、Mishra Sushil K.、Neyazaki Makiko、Oi Rika、Ikeda Akemi、Matsugaki Naohiro、Akashi Satoko、Manya Hiroshi、Mizuno Mamoru、Yagi Hirokazu、Kato Koichi、Senda Toshiya、Endo Tamao、Nogi Terukazu、Yamaguchi Yoshiki
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 22 ページ: 348～359
  • DOI: https://doi.org/10.1111/gtc.12480
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Tatsushi Toda and Tamao Endo win 107th Japan Academy Prize (2017)
  • 著者名/発表者名: Kanagawa Motoi、Manya Hiroshi
  • 雑誌名: Glycobiology 巻: 27 ページ: 599～600
  • DOI: https://doi.org/10.1093/glycob/cwx040
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Experimental phase determination with selenomethionine or mercury-derivatization in serial femtosecond crystallography (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamashita Keitaro, et al.
  • 雑誌名: IUCrJ 巻: 4 ページ: 639～647
  • DOI: https://doi.org/10.1107/S2052252517008557
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Glycosylation with ribitol-phosphate in mammals: New insights into the O -mannosyl glycan (2017)
  • 著者名/発表者名: Manya Hiroshi、Endo Tamao
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 巻: 1861 ページ: 2462～2472
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2017.06.024
  • 査読あり
• [雑誌論文] POMGnT1の構造解析による筋ジストロフィー疾患発症機序解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 桑原 直之、加藤 龍一、萬谷 博、遠藤 玉夫
  • 雑誌名: 日本結晶学会誌 巻: 59 ページ: 114～120
  • DOI: https://doi.org/10.5940/jcrsj.59.114
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] 哺乳類におけるリビトールリン酸含有糖鎖の発見とO-マンノース型糖鎖の生合成機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 萬谷 博、遠藤 玉夫
  • 雑誌名: 生化学 巻: 89 ページ: 605～612
  • DOI: https://doi.org/10.14952/SEIKAGAKU.2017.890605
• [学会発表] 筋ジストロフィー症原因遺伝子産物TMEM5によるジストログリカンの機能糖鎖修飾 (2017)
  • 著者名/発表者名: 萬谷博, 山口芳樹, 金川基, 小林千浩, 田尻道子, 赤阪-萬谷啓子, 川上宏子, 水野真盛, 和田芳直, 戸田達史
  • 学会等名: 第36回日本糖質学会年会
• [学会発表] ジストログリカノパチー原因遺伝子産物Protein O-Mannosyl Kinase (POMK)の構造生物学的研究,ポスター (2017)
  • 著者名/発表者名: 長江雅倫, Sushil K. Mishra, 根谷崎牧子, 大井里香, 池田明美, 松垣直宏, 明石知子, 萬谷博, 水野真盛, 矢木宏和, 加藤晃一, 千田俊哉, 遠藤玉夫, 禾晃和, 山口芳樹
  • 学会等名: 第36回日本糖質学会年会
• [学会発表] Fukutin-related protein (FKRP)の結晶構造と基質認識機構解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 桑原直之, 萬谷博, 金川基, 今江理恵子, 田中智博, 小林千浩, 戸田達史, 水野真盛, 遠藤玉夫, 加藤龍一
  • 学会等名: 第36回日本糖質学会年会
• [学会発表] Carbohydrate-binding domain of the POMGnT1 stem region modulates O-mannosylation sites of α-dystroglycan (2017)
  • 著者名/発表者名: Naoyuki Kuwabara, Hiroshi Manya, Takeyuki Yamada, Hiroaki Tateno, Motoi Kanagawa, Kazuhiro Kobayashi, Keiko Akasaka-Manya, Yuriko Hirose, Mamoru Mizuno, Mitsunori Ikeguchi, Tatsushi Toda, Jun Hirabayashi, Toshiya Senda, Tamao Endo, Ryuichi Kato
  • 学会等名: 4th International Symposium on Glyconjugates (GlycoXXIV)
  • 国際学会
• [学会発表] 新規O-マンノース型糖鎖の発見とその異常による先天性筋ジストロフィー症 (2017)
  • 著者名/発表者名: 萬谷博
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）
  • 招待講演
• [学会発表] POMGnT1の構造解析による筋ジストロフィー疾患発症機序解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 桑原直之, 萬谷博, 山田健之, 舘野浩章, 金川基, 小林千浩, 赤阪-萬谷啓子, 弘瀬友理子, 水野真盛, 池口満徳, 戸田達史, 平林淳, 千田俊哉, 遠藤玉夫, 加藤龍一
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）
• [学会発表] 哺乳類細胞発現系によるFukutin-related protein (FKRP)の大量精製と結晶構造決定 (2017)
  • 著者名/発表者名: 桑原直之, 萬谷博, 今江理恵子, 遠藤玉夫, 千田俊哉, 加藤龍一
  • 学会等名: 2017年度量子ビームサイエンスフェスタ
• [学会発表] 筋ジストロフィー症原因遺伝子産物フクチンはジストログリカン糖鎖にグリセロールリン酸を導入する活性を有する (2017)
  • 著者名/発表者名: 今江理恵子, 萬谷博, 津元裕樹, 田中智博, 水野真盛, 金川基, 小林千浩, 戸田達史, 遠藤玉夫
  • 学会等名: 日本薬学会第138年会
• [備考] 東京都健康長寿医療センター研究所
  • URL: http://www.tmghig.jp/research/index.html