| 研究課題/領域番号 |
17H03987
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| 研究機関 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所) |
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研究代表者 |
萬谷 博 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究副部長 (20321870)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 糖鎖 / 神経疾患 / 筋疾患 / O-マンノース型糖鎖 |
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| 研究実績の概要 |
O-マンノース（Man）型糖鎖には多様な構造が存在し、構造の特徴によりコアM1、コアM2、コアM3の3タイプに分類される。コアM3の合成不全は中枢神経障害を伴う先天性筋ジストロフィー症の原因となる。我々は、コアM3にリビトールリン酸（RboP）が含まれることを発見し、コアM3の構造と生合成機構を解明してきた。本研究では、O-Man型糖鎖合成に関わる糖転移酵素群の機能を解析することで、多様な構造の存在意義や多様な構造をつくるメカニズムの解明を目指している。コアM3の生合成では、RboP転移酵素fukutinとFKRPによりCDP-リビトール（CDP-Rbo）からRboPが転移されRboP-RboPタンデム構造が形成される。本年度は、FKRPのX線結晶構造の解明に成功し、基質認識機構と患者変異による影響を検討した。N末側の細胞質領域と膜貫通領域を除いた可溶型FKRPをHEK293細胞で発現、精製し、X線結晶構造解析に用いた。結晶構造からFKRPは幹領域と触媒領域に分けられ、幹領域を介して四量体を形成していた。基質との共結晶解析から、触媒ポケットの形成には2分子のFKRPが必要であり、一方の分子の幹領域でコアMan（ManP）のリン酸を認識し、もう一方の分子の触媒領域でRboPのリン酸とCDP-Rboと相互作用することが明らかとなった。また、FKRPはManPのリン酸を除去した基質にはRboPを転移できず、FKRP基質認識にはManPが必要であることが確認された。さらに、患者変異（Y88F,S221R,L276I）を導入した変異型FKRPはゲル濾過クロマトグラフィーで低分子量画分に検出されたことから四量体を形成できないことが示された。変異型FKRPの酵素活性は野生型に比較して顕著に低く、変異による四量体形成の阻害が酵素活性減少の原因となることが考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2017年度のPOMKの結晶構造解明に引き続き、今年度はFKRPの結晶構造の解明に成功し、O-Man型糖鎖合成関連酵素のX線結晶構造解析は順調に進捗している。FKRPの酵素活性に、コアM3糖鎖の2個のリン酸との相互作用が必要であることなど、O-Man型糖鎖の生合成の新たなメカニズムが明らかとなった。こうした結晶構造解析による基質認識機構の解明は、O-Man型糖鎖がどのような構造の糖鎖あるいはタンパク質の上に合成されるのかを調べる上で重要であり、また、変異による疾患発症のメカニズムを理解する上で重要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
2018年度に引き続き以下の計画を進める。
（１）O-Man型糖鎖合成関連酵素の構造と機能の解析： X線構造解析により、各酵素の基質認識機構およびドメイン構造と各ドメインの機能を解析する。生化学的手法により構造解析から得られる情報と酵素活性などとの関連を解析し、疾患型変異による機能への影響や病態との関連を検討する。2018年度にFKRPの結晶構造を解明し論文化したことから、今年度よりFKTNとTMEM5の結晶化を進める。
（２）RboP糖鎖およびO-Man型糖鎖修飾タンパク質の探索：これまでに報告されたRboP含有糖鎖は、哺乳類ではα-ジストログリカンに修飾されたO-Man型糖鎖のみであり、他のタンパク質の修飾は不明である。そこで、リビトールリン酸糖鎖の他タンパク質における修飾を調べる。
（３）CDP-Rboトランスポーターの同定： O-Man型糖鎖の合成は小胞体およびゴルジ体内腔で行われるため、細胞質で合成された糖供与体はトランスポーターによりゴルジ内腔へ輸送される。RboPの供与体となるCDP-リビトールのトランスポーターは未だ同定されていないため、CDP-Rboトランスポーターの活性測定法を確立し同定を目指す。
（４）RboPおよびグリセロールリン酸（GroP）糖鎖の生合成経路と糖鎖機能の解析：哺乳類におけるリビトールリン酸の生合成経路の解明を目指す。また、2018年度にRboPの代わりにGroPが修飾された新規構造の合成酵素を同定し、その合成に利用される新規供与体CDP-Groを発見した。哺乳類ではCDP-Groの代謝経路は未知であり、GroP修飾の意義も不明であることから、本糖鎖の合成機構と機能について調べる。
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