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2017 年度 実績報告書

ゲノム編集による改良型ウイルス感染宿主細胞の構築

研究課題

研究課題/領域番号 17H04003
研究機関国立感染症研究所

研究代表者

花田 賢太郎  国立感染症研究所, 細胞化学部, 部長 (30192701)

研究分担者 齊藤 恭子  国立感染症研究所, 細胞化学部, 主任研究官 (70235034)
佐久間 智理  国立感染症研究所, 細胞化学部, 研究員 (80782888)
研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2021-03-31
キーワード宿主細胞 / Vero細胞 / ゲノム編集 / フラビウイルス / 内在性レトロウイルス / ワクチン / レギュラトリーサイエンス
研究実績の概要

本課題ではゲノム編集技術を駆使して、フラビウイルスの感染増殖性が更新した改良型培養細胞の構築を目指している。黄熱ウイルスレプリコンを利用して、同ウイルスの複製能が更新した細胞を構築する試みについては、計画通り、主要ツールとなる同ウイルスレプリコンの作製を完了した。すなわち、既報を参考に黄熱ウイルスYF17D株ゲノムRNAを基にして、同ウイルスのサブゲノミックレプリコンcDNAを得た。これをプラスミドに組み込み、in vitro転写反応でサブゲノミックレプリコンRNAを作製することができた。ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質をレポーター遺伝子として発現するレプリコンを作製し、YF17D複製能をモニターする系を確立した。
一方で、多様なウイルスに感受性の高いVero細胞において継代歴の異なる3細胞亜株(JCRB0111, ATCC CCL81, Vero 76)の全ゲノム配列を決定し、その比較解析した。その結果、Vero細胞ゲノムの83か所にsimian endogenous type D retrovirus(SERV)が挿入されており、これら挿入箇所は三細胞株で一致していることを見出した。また、特異的なPCRプライマーが設計可能であった12個の挿入SERVをVero細胞ゲノムから回収してそれぞれ単独に配列決定を行ったところ、その2つは完全長の無傷SERV配列を持っていた。これらの結果から、Vero細胞の樹立以降、当該細胞ゲノム中のSERVは、通常の継代培養をしている限りレトロトランスポーズしていないことが明らかになったとともに、SERVに由来する感染性粒子がVero細胞を基材として生産されたワクチン、特に生ワクチンに混在しないよう留意すべきことも示唆された。
また、自然免疫経路を遮断してウイルス生産性を向上させることを意図し、ゲノム情報をもとにしていくつかの自然免疫経路系遺伝子ノックアウトしたVero細胞変異株をゲノム編集により作製した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

既報を参考に黄熱ウイルスYF17D株ゲノムRNAを基にして、同ウイルスのサブゲノミックレプリコンcDNAを得た。これをプラスミドに組み込み、in vitro転写反応でサブゲノミックレプリコンRNAを作製することができた。ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質をレポーター遺伝子として発現するレプリコンを作製し、YF17D複製能をモニターする系を確立した。Vero細胞のゲノム中にはSERVの配列が挿入されている。Vero細胞においてトランスクリプトーム解析を行ったところ、DNAのメチル化阻害によりSERV遺伝子の転写が強く誘導された。また、3株のVero細胞亜株のゲノムを比較した結果、Vero細胞ゲノム中の84カ所にSERV配列が挿入されており、1カ所を除いては3株間で挿入位置が一致していた。さらに、12カ所のSERV配列をPCRにより増幅し配列を決定したところそれぞれの配列も3株間で完全に一致していた。配列を決定した12個のSERVのうち2個は完全長のSERVであることが明らかとなった。Vero細胞のゲノム情報をもとに、自然免疫系の細胞内シグナル伝達分子を標的としたsingle guide RNA(sgRNA)を設計した。このsgRNAとCRISPR/CAS9システムを用いてノックアウト細胞を作製することができた。

今後の研究の推進方策

黄熱ウイルスYF17Dレプリコンに関しては、適切なコントロールの作製と条件検討を行い、当該レプリコンを用いた同ウイルスの複製に関与する因子のゲノム編集技術によるスクリーニング系構築を目指す。一方、Vero細胞に関しては、作製したノックアウト細胞のJEV増殖性を親細胞と比較する。また、Vero細胞ゲノムに見出された全長SERVのプロウイルスDNAのクローニングを行い、同遺伝子の複製能とウイルス粒子形成能を検出する実験系の構築を試みる。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件) (うち国際学会 1件、 招待講演 1件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Novel endogenous simian retroviral integrations in Vero cells: implications for quality control of a human vaccine cell substrate2018

    • 著者名/発表者名
      Chisato Sakuma, Tsuyoshi Sekizuka, Makoto Kuroda, Fumio Kasai, Kyoko Saito, Masaki Ikeda, Toshiyuki Yamaji, Naoki Osada, and Kentaro Hanada
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 8 ページ: -

    • DOI

      10.1038/s41598-017-18934-2

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Endogenous Simian Retrovirus Variations in Vero Cells: Implications for Quality Control of a Human Vaccine Cell Substrate2018

    • 著者名/発表者名
      Chisato Sakuma, Tsuyoshi Sekizuka, Makoto Kuroda, Fumio Kasai, Kyoko Saito, Masaki Ikeda, Toshiyuki Yamaji, Naoki Osada, Kentaro Hanada
    • 学会等名
      4th International Symposium for Medicinal Sciences, 2018.3.25-28, Kanazawa
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Comparative characterization of human hepatoma-derived Huh7.5.1-8 cells and African green monkey kidney-derived Vero cells in Japanese encephalitis virus production ヒト肝癌由来Huh7.5.1-8細胞とアフリカミドリザル腎由来Vero細胞における日本脳炎ウイルス産生の比較解析2017

    • 著者名/発表者名
      齊藤恭子、深澤征義、白砂圭崇、鈴木亮介、脇田隆字、小西英二、花田賢太郎
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017)
  • [備考] Vero細胞の物語 ~その樹立からゲノム構造の決定、そして未来へ~

    • URL

      http://www.nih.go.jp/niid/ja/chlamydia-pneumonia-m/818-biochem/5752-vero.html

  • [備考] 動物細胞培養に関する用語など

    • URL

      http://www.nih.go.jp/niid/ja/chlamydia-std-m/1880-biochem/3255-2013-02-25-05-58-54.html

URL: 

公開日: 2018-12-17  

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