| 研究課題/領域番号 |
17H04003
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
花田 賢太郎 国立感染症研究所, 細胞化学部, 部長 (30192701)
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| 研究分担者 |
齊藤 恭子 国立感染症研究所, 細胞化学部, 主任研究官 (70235034)
佐久間 智理 国立感染症研究所, 細胞化学部, 研究員 (80782888)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / 感染症 / フラビウイルス / Vero細胞 / Huh7細胞 / ヒト神経芽腫由来細胞 / プリオン |
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| 研究実績の概要 |
本課題ではゲノム編集技術を駆使して、フラビウイルスの感染増殖性が更新した改良型培養細胞の構築を目指している。黄熱ウイルスYF17Dレプリコンを利用して、同ウイルスの複製能が更新した細胞を探索するため、レプリコンが持続発現しているレプリコン細胞を作製し、Cas9を発現させた。また、ヒト肝がん由来Huh7系列の亜株でC型肝炎ウイルス（HCV）の産生能が高いHuh7.5.1-8について、フラビウイルス産生能をVero細胞と比較解析し、Huh7.5.1-8細胞のウイルス学的な有用性を見出した。一方で、極めて感染能の高いHCV-JFH1亜株を分離した。
さらに、ヒトゲノムCRISPR single-guide RNAライブラリを用い、フラビウイルスの一つである日本脳炎ウイルス（JEV）の感染増殖に必要な宿主細胞遺伝子の探索を行った。その結果、JEVの増殖に関わる宿主遺伝子の候補を複数得た。
また、異常型プリオンに起因するヒトプリオン病には、さまざまな遺伝子多型のあることが知られているが、これらプリオン多型変異体を内在性プリオンタンパク質の干渉を受けずに解析できるヒト培養細胞実験系は樹立されていなかった。そこで、感染性プリオン研究に役立つ細胞解析系の構築を目指し、ゲノム編集法を用いて内在性プリオン遺伝子を破壊したヒト神経芽腫由来細胞変異株を樹立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
黄熱ウイルスYF17D株の複製装置を利用してレポーター遺伝子を発現させるレプリコンを作製し、実際に複製能を有することを確認した。また、当該レプリコンを持続的に発現するレプリコン細胞を樹立し、ゲノム編集のためのCas9を発現させた株を樹立した。さらに、YF17Dの複製に特異的な宿主因子を絞り込む際に有用な、ネガティブコントロール細胞も作製した。
当研究室で当初HCV高産生を指標に樹立されたHuh7.5.1-8細胞は、フラビウイルス属のJEVについてもVero細胞と同等のウイルス産生量を示し、特に感染初期にウイルス産生量がVero細胞よりも高いことを見出した。Huh7.5.1-8細胞はVero細胞よりも顕著な細胞変性効果を示した他、JEVのプラークを早期から形成し、より大きなプラークを形成した。このようなHuh7.5.1-8細胞の特徴は、フラビウイルスの産生・分離や、検出に有用であると考えられた。また、本課題の目指すフラビウイルスの感染増殖性が亢進した改良型細胞構築のための親細胞としても有望であると考えられた。一方で、従来のHCV-JFH1株に比べて格段に感染性の高い亜株を分離し、従来株では感染がほとんど成立しない肝臓系培養細胞でもこの新規分離亜株は有意な感染能を示す事を見出した。
Huh7.5.1-8細胞を親株として、CRISPR/CAS9システムによるJEVの感染増殖に関わる宿主因子のゲノムワイドスクリーニングを行ったところ、複数の候補遺伝子が得られた。候補遺伝子のそれぞれについてノックアウト細胞を作製し、JEV感染実験を行ったところ親株と比較してJEVの増殖が遅れることが示された。
また、感染性プリオン研究に役立つ細胞解析系の構築を目指し、ゲノム編集法を用いて内在性プリオン遺伝子を破壊したヒト神経芽腫由来細胞変異株を樹立した。
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| 今後の研究の推進方策 |
・YF17Dレプリコンを用いた同ウイルスの複製に関与する因子のスクリーニング系について検討をさらに進め、実際にスクリーニングを実施する。また、レプリコン細胞からインターフェロンによる治癒細胞を構築し、フラビウイルスの産生能について調べる。
・Huh7.5.1-8細胞に見られたフラビウイルス高産生能についてさらに解析を進め、フラビウイルスの感染増殖性が亢進した改良型細胞構築のための手がかりを得る。
・Vero細胞ゲノムに見出された内在性サルレトロウイルスのプロウイルスDNAのクローニングを行い、同遺伝子の複製能とウイルス粒子形成能を検出する実験系の構築を試みる。
・内在性プリオン遺伝子を破壊したヒト神経芽腫由来細胞変異株にヒトプリオン病に関連したプリオン多型変異体を安定発現し、内在性プリオンの干渉の無い条件下で性状解析する。
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