新たに発見したCRH放出経路の生理的意義の解明および既知HPA軸との関係について

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H04025
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50254272)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 摂食 / 室傍核 / HPA Axis / CRH / 弓状核

研究実績の概要

１．正中隆起に投射する弓状核GABA細胞のサブタイプの同定：FluoroGoldをマウス腹腔内に注射し、弓状核の切片を作製し、抗AgRP抗体を用いて免疫染色し、正中隆起に投射する弓状核GABA細胞がAgRP細胞であることを同定した。
２．低栄養モデルの作製と正中隆起に投射する弓状核GABA細胞の反応の評価：同定した正中隆起投射性AgRP細胞が飢餓ストレスに応答することを確認するため、１．のモデルに摂餌制限（-30%）を1週間行い、FluoroGold 陽性のAgRP細胞でのc-fos発現上昇を免疫染色で確認した。また、室傍核においてもFluoroGold 陽性のCRH細胞でのc-fos発現上昇を確認した。
３．AgRP細胞可視化マウスの作製：１-２の結果から飢餓ストレスに応答するAgRP細胞が正中隆起に投射していることを確認し、AgRP細胞の可視化マウス作製に取り掛かった。AgRP細胞でCreを発現しているマウス(AgRP -IRES-Cre)とCre依存性にDREADD（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）を発現するマウス（R26-hM3Dq/mCitrine）を交配してホモ化し、AgRP細胞で選択的に黄色蛍光蛋白mCitrineおよびGq-DREADDを発現するマウス（AgRP-mCitrine-DREADD）を作製した。
４．AgRP細胞の電気生理学的解析：３．で作製したマウスを利用し、弓状核―正中隆起を含む脳スライス標本を作製し、蛍光標識したAgRP細胞を同定した。これにより同定したニューロンのグルココルチコイドやグレリンの急性投与に対する膜電流応答および細胞内Ca2+応答を記録できる系を確立した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

正中隆起に投射する弓状核GABA細胞のサブタイプの同定、低栄養モデルの作製と正中隆起に投射する弓状核GABA細胞の反応の評価、AgRP細胞可視化マウスの作製は交付申請書に記載した「研究の目的」どおりに達成した。しかし、AgRP細胞の電気生理学的解析では、系は確立したものの、まだ実際の記録は行っていない。ただし、記録そのものはすぐにでも可能であるので、全体としては、おおむね順調に進展していると自己評価した。

今後の研究の推進方策

まず、CRH-GCaMP3マウス・ホモとAgRP-mCitrine-DREADDマウス・ホモと交配し、AgRP細胞選択的にmCitrineとGq-DREADDを、CRH細胞選択的にGCaMP3を発現するマウスを作出する。スライス標本を作製してCNO投与により、AgRP細胞が興奮することを確認し、CRH神経の細胞内Ca2+応答を記録する。ついで、AgRP-mCitrine-DREADD/CRH-GCaMP3マウスにCNOを投与し、室傍核のCRHニューロン細胞体の活動を、c-fosの発現で確認し、血中ACTHとCORTを測定し、CRH分泌促進を確認する。さらにAgRP Cre/Cre -mCitrine-DREADDマウスとGAD67flox/floxマウスを交配し、AgRPCre/+-mCitrine-DREADD /GAD67flox/+を作製する。NKCC1flox/floxマウスは入手繁殖する。以上が遂行出来たらAgRP-mCitrine-DREADD/CRH-GCaMP3マウスに、低栄養ないし拘束ストレスを行い、各々で血中ACTHとCORTの変化を測定し、c-fosの発現部位を比較する。さらに胎仔CRH細胞のKCC2が機能しているかどうか、グラミシジンパッチクランプを行って[Cl-]iを確認する。もし機能していない場合はリン酸化と蛋白局在の解析を行う。正中隆起へのCRH投射（GCaMP3）とGABA投射（mCitrine）の完成時期を確認する。さらに、NKCC1発現時期も免疫染色法で明らかにする。以上から胎仔における既知HPA軸と新規HPA軸の機能的発達過程を検討する。

研究成果

• [国際共同研究] Yale School of Medicine(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Yale School of Medicine
• [国際共同研究] マインツ大学(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: マインツ大学
• [雑誌論文] MHC class I in dopaminergic neurons suppresses relapse to reward seeking (2018)
  • 著者名/発表者名: Murakami G, Edamura M, Furukawa T, Kawasaki H, Kosugi I, Fukuda A, Iwashita T, Nakahara D.
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 4:eaap7388 ページ: -
  • DOI: 10.1126/sciadv.aap7388
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Optical measurement of glutamate in slice preparations of the mouse retina (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohkuma M, Kaneda M, Yoshida S, Fukuda A, Miyachi E.
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: In press ページ: In press
  • DOI: 10.1016/j.neures.2018.03.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Biallelic Variants in CNPY3 , Encoding an Endoplasmic Reticulum Chaperone, Cause Early-Onset Epileptic Encephalopathy (2018)
  • 著者名/発表者名: Mutoh H, Kato M, Akita T, Shibata T, Wakamoto H, Ikeda H, Kitaura H, Aoto K, Nakashima M, Wang T, Ohba C, Miyatake S, Miyake N, Kakita A, Miyake K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
  • 雑誌名: The American Journal of Human Genetics 巻: 102 ページ: 321-329
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2018.01.004
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] De novo variants in CAMK2A and CAMK2B cause neurodevelopmental disorders (2018)
  • 著者名/発表者名: Akita T, Aoto K, Kato M, Shiina M, Mutoh H, Nakashima M, Kuki I, Okazaki S, Magara S, Shiihara T, Yokochi K, Aiba K, Tohyama J, Ohba C, Miyatake S, Miyake N, Ogata K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
  • 雑誌名: Annals of Clinical and Translational Neurology 巻: 5 ページ: 280-296
  • DOI: 10.1002/acn3.528
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Taurine as an Essential Neuromodulator during Perinatal Cortical Development (2017)
  • 著者名/発表者名: Kilb W, Fukuda A.
  • 雑誌名: Frontiers in Cellular Neuroscience 巻: 11:328 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fncel.2017.00328
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] De novo CaMKⅡα/β mutants causing neurodevelopmental disorders upregulate A-type voltage-dependent K+ currents in hippocampal neurons. (2018)
  • 著者名/発表者名: Akita T, Aoto K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] WNK3 kinase regulates inwardly rectifying potassium current in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sinha Adya S, Hosoi Y, Sohara E, Mutoh H, Akita T, Uchida S, Fukuda A.
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] Temporally genetic expression of KCC2 in GnRH neurons in vivo causes impairment of fertility. (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe M, Nabekura J, Fukuda A.
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] タウリン欠乏はGABAA受容体のリン酸化状態を変化させることにより大脳皮質感覚野錐体細胞におけるポストシナプスのGABAA受容体数を減少させる. (2018)
  • 著者名/発表者名: 細井泰志, 渡部美穂, 秋田天平, 武藤弘樹, 伊藤崇志, 福田敦夫.
  • 学会等名: 第4回国際タウリン研究会日本部会
• [学会発表] The role of GABAergic interneuron-astrocyte interaction in epileptic seizures. (2018)
  • 著者名/発表者名: Mutoh, H., Fukuda, A.
  • 学会等名: 第１回山梨大学先端脳科学特別教育プログラム国際シンポジウム
  • 国際学会
• [学会発表] GABA synaptic dynamics and astrocytic Cl- buffering underlying neural network oscillation. (2017)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫.
  • 学会等名: 第47回日本臨床神経生理学会学術大会
• [学会発表] A novel CRH secretory mechanism by an excitatory GABAergic input from the arcuate nucleus to the median eminence. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, A.
  • 学会等名: The 17th Hamamatsu-Kyungpook Joint Medical Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sinha Adya, S., Hosoi, Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S., Fukuda, A.
  • 学会等名: The 17th Hamamatsu-Kyungpook Joint Medical Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Prenatal stress on Gad1-heterozygotes perturbs GABAergic neurogenesis, GABAergic synapse formation and behavioral phenotypes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, A. Wang, T., Sinha Adya, S., Yanagawa, Y., Kawai, T. and Hata, K.
  • 学会等名: Neuroscience 2017
  • 国際学会
• [学会発表] Constitutive phosphomimetic inhibition of KCC2 at Thr906/Thr1007 causes GABA-dependent network excitability, seizure, and early postnatal death. (2017)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, M., Duan, J., Mansuri, M., Zhang, J., Fukuda, A. and Kahle, K.T.
  • 学会等名: Neuroscience 2017
  • 国際学会
• [学会発表] KCC2 dysfunction underlying infantile and neonatal seizures in an animal model. (2017)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫, 渡部美穂, 秋田天平, Kahle, K.
  • 学会等名: 第51回日本てんかん学会学術集会
• [学会発表] Prenatal stress on Gad1- heterozygotes affects inhibitory synaptic transmission. (2017)
  • 著者名/発表者名: Wang, T., Sinha Adya, S., Akita, T., Yanagawa, Y., Fukuda, A.
  • 学会等名: 生理学研究所研究会「シナプス・神経回路機能の時空間制御」
• [学会発表] Prenatal stress on Gad1-heterozygotes perturbs development of brain and behavior by epigenetic mechanism. (2017)
  • 著者名/発表者名: Wang T, Sinha AS, Yanagawa Y, Kawai T, Hata K and Fukuda A.
  • 学会等名: 第44回日本脳科学会
• [学会発表] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sinha Adya, S., Hosoi, Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S. and Fukuda, A.
  • 学会等名: 第64回中部日本生理学会
• [学会発表] 生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロン制御における興奮性GABA入力の役割. (2017)
  • 著者名/発表者名: 渡部美穂, 鍋倉淳一, 福田敦夫.
  • 学会等名: 第64回中部日本生理学会
• [学会発表] てんかん原性獲得過程における抑制性神経とグリア細胞の相互作用. (2017)
  • 著者名/発表者名: 武藤弘樹, 福田敦夫.
  • 学会等名: 第64回中部日本生理学会
• [学会発表] A novel CRH secretory mechanism by GABAergic input from the arcuate nucleus to the axon terminals of high [Cl-]i. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, A.
  • 学会等名: Seminar of Center for Neuron-Glia Interaction, KIST(Korea Institute of Science and Technology)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Taurine depletion reduces postsynaptic GABAA receptors in layer 2/3 pyramidal neurons of the somatosensory cortex. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hosoi, Y., Akita, T., Watanabe, M., Mutoh, H., Miyajima, H. and Fukuda, A.
  • 学会等名: XXIII World Congress of Neurology（WCN2017）
  • 国際学会
• [学会発表] 母体ストレスとGABAが仔脳発達に与える病態生理学的影響. (2017)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫, 王天英, Sinha Adya S, 柳川右千夫, 河合智子, 秦健一郎.
  • 学会等名: 第27回日本病態生理学会大会
• [学会発表] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sinha Adya, S., Hosoi,Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S. and Fukuda, A.
  • 学会等名: 第40回日本神経科学大会
• [学会発表] The role of GABAergic interneuron-astrocyte interaction in epileptic seizures. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mutoh, H., Fukuda, A.
  • 学会等名: 第40回日本神経科学大会
• [学会発表] Cellular Mechanisms Underlying Status Epilepticus: what do animal models tell us? (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, A.
  • 学会等名: The 19th Annual Meeting of Infantile Seizure Society International Symposium on Status Epilepticus in Infants and Children
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Prenatal stress on Gad1-heterozygotes selectively perturbs parvalbumin (PV)-positive GABAergic neurogenesis, GABA synapses and social interaction behavior. (2017)
  • 著者名/発表者名: Wang, T., Sinha Adya, S., Yanagawa, Y., Kawai, T., Hata, K. and Fukuda, A.
  • 学会等名: IBNS 26th Annual Meeting
  • 国際学会
• [備考] 浜松医科大学医学部神経生理学講座ホームページ
  • URL: http://www.hama-med.ac.jp/uni_education_igakubu_igaku_seiri1.html