RNA制御に基づいた心機能調節の分子機構解明と心不全治療応用

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H04028
• 研究機関: 秋田大学
• 研究代表者: 久場 敬司 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10451915)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: deadenylation / CCR4-NOT / CNOT3 / Atg7 / heart failure / cardiomyocyte / cell death

研究実績の概要

本研究課題達成のために平成29年度は下記の検討を行った。
１）デアデニレース因子の標的RNAの探索：マウス心臓組織を用いたCNOT3のRIP-seqによりCCR4-NOTデアニレースの標的RNAの探索を行った結果、転写制御やヒストン調節の経路が濃縮されていることが分かった。さらに、CNOT3がATG7 mRNAに結合することが分かった。実際、ATG7 mRNAについて、CNOT3欠損の心臓組織を用いたPAT assayやポリソーム分画の解析から、Cnot3がmRNAポリA鎖の分解、翻訳抑制を介してATG7の蛋白発現レベルを制御することが分かった。
２）CCR4-NOT欠損によるATG7細胞死活性化機構の解明： Cnot3欠損細胞の免疫染色やプルダウンの解析からpoly(A)鎖の分解不全の状態では、Atg7がp53核内で結合することが分かった。クロマチン免疫沈降の解析から、Atg7あるいはp53が細胞死遺伝子の転写を活性化することが分かった。さらに、Atg7の核内移行はp53依存的であることが分かり、Atg7がp53核内で協調的に細胞傷害を引き起こすことが分かった。
３）CCR4-NOT複合体の構成因子によるRNA認識機構の解析：CCR4-NOT複合体の構成因子について、PAR-CLIP-seqの解析を行ったところ、蛋白とクロスリンクされたRNA配列を検出することができた。ところが詳細な解析の結果、CCR4-NOT構成因子と共沈したRNA結合蛋白（RBP）がRNAと結合していてクロスリンクされたことが分かった。この構成因子について、相互作用蛋白を同定するために免疫沈降、質量分析を行ったところ、候補のRBPを同定することができた。現在、このRBP候補についてさらなる検討を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

RNA制御に基づいた心機能調節の分子機構解明に向けて成果を上げつつある。

今後の研究の推進方策

CCR4-NOTによるRNA認識制御機構の解明のために、前年度からのPAR-CLIP-seqによる解析結果に基づき、CCR4-NOTと会合するRNA結合蛋白（RBP）によるRNA認識機構について、生化学的な解析ならび細胞生物学的な解析を進める。このRBPの制御機構の生理学的意義をシグナル伝達と蛋白修飾の観点から明らかにする。
RNA ポリA鎖分解によるエネルギー代謝制御機構の解明のためにRNA poly(A)の代謝フラックスを検討する。安定同位体（13C, 15N）ラベルのpoly(A)鎖の細胞内における代謝動態をメタボロームで解析する実験システムで、ミトコンドリア呼吸鎖阻害、細胞の電気刺激、進展刺激などによるpoly(A)鎖アデニンの代謝動態を解析する。
さらに、CRISPR/Cas9ライブラリースクリーニングによるCCR4-NOT制御因子の網羅的探索を実施する。CNOT1欠損細胞株にCRISPR/Cas9レンチウイルスライブラリーを遺伝子導入し、CNOT1欠損による細胞死に影響を及ぼすCRISPR gRNAをスクリーニングする。

研究成果

• [雑誌論文] [New aspects of poly(A) tail shortening of mRNA in controlling heart functions] (2018)
  • 著者名/発表者名: Kuba K.
  • 雑誌名: Nihon Yakurigaku Zasshi 巻: 151(3) ページ: 94-99
  • DOI: 10.1254/fpj.151.94.
• [雑誌論文] The CCR4-NOT deadenylase complex controls Atg7-dependent cell death and heart function. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi T, Suzuki T, Sato T, Takahashi A, Watanabe H, Kadowaki A, Natsui M, Inagaki H, Arakawa S, Nakaoka S, Koizumi Y, Seki S, Adachi S, Fukao A, Fujiwara T, Natsume T, Kimura A, Komatsu M, Shimizu S, Ito H, Suzuki Y, Penninger JM, Yamamoto T, Imai Y, Kuba K.
  • 雑誌名: Sci Signal. 巻: Feb 6;11(516) ページ: 3638
  • DOI: 10.1126/scisignal.aan3638
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Loss of Apela Peptide in Mice Causes Low Penetrance Embryonic Lethality and Defects in Early Mesodermal Derivatives. (2017)
  • 著者名/発表者名: Freyer L, Hsu CW, Nowotschin S, Pauli A, Ishida J, Kuba K, Fukamizu A, Schier AF, Hoodless PA, Dickinson ME, Hadjantonakis AK.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: Aug 29;20(9) ページ: 2116-2130.
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2017.08.014
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. (2017)
  • 著者名/発表者名: Rodrguez-Gil A, Ritter O, Saul VV, Wilhelm J, Yang CY, Grosschedl R, Imai Y, Kuba K, Kracht M, Schmitz ML.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: Jun 14;7(1) ページ: 3547
  • DOI: 10.1038/s41598-017-03708-7
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] ELABELA-APJ axis protects from pressure overload heart failure and angiotensin II-induced cardiac damage. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sato T, Sato C, Kadowaki A, Watanabe H, Ho L, Ishida J, Yamaguchi T, Kimura A, Fukamizu A, Penninger JM, Reversade B, Ito H, Imai Y, Kuba K.
  • 雑誌名: Cardiovasc Res. 巻: Jun 1;113(7) ページ: 760-769
  • DOI: 10.1093/cvr/cvx061.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] 心不全病態におけるRNA分解制御の新しい生理的意義 (2017)
  • 著者名/発表者名: 久場 敬司
  • 学会等名: 第21回 日本心不全学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] mRNA deadenylation-guided regulation of cardiac homeostasis (2017)
  • 著者名/発表者名: 久場 敬司
  • 学会等名: 理化学研究所IMS疾患生物学セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] New aspects of RNA decay in controlling heart function (2017)
  • 著者名/発表者名: 久場 敬司
  • 学会等名: 富山大学 大学院特別セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] RNA deadenylation-guided control of cardiac homeostasis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kuba K
  • 学会等名: Cutting Edge Developments in RNA Biology for the Control of Gene Expression.
  • 国際学会