| 研究課題/領域番号 |
17H04036
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
久武 幸司 筑波大学, 医学医療系, 教授 (70271236)
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| 研究分担者 |
福田 綾 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (50436276)
西村 健 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (80500610)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / リプログラミング / MET / EMT / uORF / INHAT / サイレンシング / レトロウイルス |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までの研究で同定した、数個のMET/EMT関連遺伝子を過剰発現させて、iPS細胞のコロニー数減少を確認していた。しかし、これらの遺伝子は、過剰発現によってプログラミングとは無関係にMEF細胞を死滅させることが分かった。そこで、MET/EMT関連遺伝子によるiPS細胞コロニー数減少への影響を正確に測定するために、MET/EMT関連遺伝子の発現を内在性のものを同程度に下げるベクターの開発をおこなった。具体的には、サイトメガロウイルス由来のupstream open reading frame(uORF)をベクターに導入し、発現レベルを数十分の１に下げたベクターを開発した。このベクターを用いて、上記遺伝子の再評価を行うと、Osr2は低発現でもiPS細胞誘導でのEMTを阻害し、コロニー数を減少させることが確認できた。TGFβでNMuMG細胞にEMTを誘導する系でOsr2の機能を検証すると、Osr2は、TGFβと同様にNMuMG細胞にてEMTを誘導し、TGFβと細胞内シグナル伝達経路を共有しているが、それとは別の経路もあることが示唆された。
一方、遺伝子発現調節関連では、iPS細胞誘導時のクロマチンやリプログラミング因子の結合状態を、RNA seqやChIP seq、さらにiChIPやCAPTURE法などの最新手法を用いて、リプログラミング因子と協同で作用する因子を探索した。これらの結果より、リプログラミング因子と協同で作用する転写因子群を十数個同定した。また、リプログラミング因子が多能性を維持するさいに必要な因子として、RNAスプライシング因子を数個同定している。さらに、iPS細胞誘導時に起こるレトロウイルスのサイレンシングについては、ヒストンアセチラーゼ阻害因子INHATの関与を明らかにし、すでに論文投稿を行い現在リバイス中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
iPS細胞誘導過程での遺伝子発現制御、特に体細胞に特異的な遺伝子を抑制する機構について大きな進展がみられた。iPS細胞誘導過程でのレトロウイルスの発現抑制に関して、センダイウイルスによるiPS細胞誘導系の特徴を上手く利用し、iChIPと併用することにより、発現抑制されたレトロウイルスゲノム上に存在する因子群を同定できた。この中には、これまで報告されていた因子以外に、ヒストンアセチル化阻害因子、RNA結合因子などが見出された。ヒストンアセチル化阻害因子（INHAT）については、すでに論文投稿にまで持っていくことが出来ており、予定よりも早く成果が挙った。また、ChIP-seq、RNA seq、CAPTUREなどにて、興味深い因子が幾つか見つかっており、さらに解析を進める予定である。以上のことより、本研究は順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、まずOsr2とEMTの関係をより詳細に解析する。とくにTGFβによるEMT誘導の細胞内シグナル伝達に、Osr２がどの程度関与するのか、TGFβとは独立の経路にはどの様なものがあるのか、またiPS細胞誘導過程でOsr2の発現が維持されると、どのようにiPS細胞誘導が阻害されるのかを明らかにする。また、Oct4、Sox2、Klf4やc-mycと協同で多能性の維持に関する候補遺伝子群に関してもその解析を進める。このなかで、DNA結合転写因子に関しては、iPS細胞誘導過程での発現変化やクロマチン上での結合変化を追跡し、Oct4、Sox2、Klf4やc-mycとどの様に協同・協調して遺伝子発現を制御しているのかを明らかにする。また、RNA結合因子については、主にスプライシングとの関係を明らかにする。多能性に関係する遺伝子は、ES細胞特異的にスプライシングされている例が多く知られており、我々に見出したRNA結合因子が、多能性特異的なスプライシングにどの程度関与しているのかを明らかにする。最後に、レトロウイルスを利用した遺伝子サイレンシングの系でも、INHAT以外の因子を同定しているので、これらについてもsiRNA、ChIP等で解析をさらに進める。
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