研究課題
微小管は代表的な細胞骨格であり、キネシンや細胞質ダイニンのようなモータータンパク質のレールとなっている。微小管はさらに中心小体や繊毛内の9+2構造の骨格としての役割以外についてはこれまで認知されていなかった。我々はヒト坐骨神経の解析から、神経細胞における細胞骨格としての微小管は従来の概念と全く異なった形態をとっていることが分かり、非定型微小管と名づけた。従来の神経細胞における微小管構造は13のプロトフィラメントをもつ単純な微小管構造が想定されていた。我々は家族性パーキンソン病の原因遺伝子・アルファシヌクレインが結合した微小管は14のプロトフィラメントをもつ特異な形状をしており、機能的にも細胞骨格としてではなく細胞内物質輸送に必要な荷台として機能する可動性微小管であることを証明した。一連の研究で実際のヒト坐骨神経の組織ではさらに複雑な形状を持った非定型微小管が多くを占めており、興味深いことに非定型微小管はラットでは0.3％、イヌでは5％、ブタでは13％最後にヒトでは20％と高度な神経機能をもつ大型哺乳類になるにつれて法則性をもって増加していることが分かった。このことは非定型微小管が高度な神経機能の形成と維持に重要な役割を果たしていることを示唆している。非定型微小管の形成に必要な微小管結合タンパク質をヒト中枢神経系から抽出したタンパク質を用いて候補を同定した。非定型微小管の進化と神経機能の高度化の研究は高度な神経機能をもつヒトの中枢神経研究に多大な示唆を与えることが期待される。
2: おおむね順調に進展している
従来の神経細胞における微小管構造は13のプロトフィラメントをもつ単純な微小管構造が想定されていた。我々は家族性パーキンソン病の原因遺伝子・アルファシヌクレインが結合した微小管は14のプロトフィラメントをもつ特異な形状をしており、機能的にも細胞骨格としてではなく細胞内物質輸送に必要な荷台として機能する可動性微小管であることを証明した。非定型微小管がどのような機能を持つかについて明らかにするために、非定型微小管形成に必要と考えられる微小管結合タンパク質を同定する。具体的にはヒト中枢神経系からタンパク質を抽出し、微小管重合の際に共沈させた。次にマウス坐骨神経でも同様の実験を行い、ヒト中枢神経系に特異的に存在する微小管結合タンパク質を質量分析器で同定することができた。候補タンパク質として、TPPP,Tau,LC2,CRIMP2などを同定することができた。次に、同定されたタンパク質の組み替えタンパク質を作製し、ブタ脳から抽出してきたチューブリンと重合実験を行い濁度の変化からチューブリンの重合に与える影響を濁度を指標に解析し、TPPP,Tau,LC2,CRIMP2はチューブリンの重合を促進することが分かった。そして、候補タンパク質を様々に組み合わせて同様の実験を行い候補タンパク質の相互作用を明らかにした。現在微小管の形状に与える効果を解析するために重合後のチューブリンを包埋し電子顕微鏡で観察している。
同定された非定型微小管形成に必要な微小管結合タンパク質の組み替えタンパク質を作製し、ブタ脳から抽出してきたチューブリンと重合実験を行い濁度の変化からチューブリンの重合に与える影響を解析し候補タンパク質の同定を行う。次に、候補タンパク質を様々に組み合わせて同様の実験を行い候補タンパク質の相互作用を明らかにする。さらに微小管の形状に与える効果を解析するために重合後のチューブリンを包埋し電子顕微鏡で観察する。この再構成実験でヒト坐骨神経に見られる非定型微小管構造が再現できるかどうかを明らかにする。次に微小管結合タンパンク質がどのように非定型微小管形成にかかわっているかを明らかにするために多数の均一な粒子を観察、撮影し、画像処理によって粒子の詳細な構造を得る手法である単粒子解析を行って結合部位を同定する。結合タンパク質の分子量が小さい場合はビオチン修飾しアビジン-ビオチン反応によって電子密度を高めることにより可視化する。これらの解析により微小管結合タンパンク質がどのようなメカニズムで非定型微小管を形成するかを明らかにする。次に、非定型微小管に蛍光標識をつけて後根神経節細胞に発現させ、後根神経節細胞の軸索伸展に与える影響、ライブセルイメージングを行うことにより軸索内での細胞内物質輸送に果たす役割を明らかにする。
すべて 2017
すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件)
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