| 研究課題/領域番号 |
17H04052
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
浅野 謙一 東京薬科大学, 生命科学部, 准教授 (10513400)
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| 研究分担者 |
濱田 理人 筑波大学, 医学医療系, 助教 (20567630)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 細胞死 / マクロファージ / CCL8 / CD169 / 大腸炎 |
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| 研究実績の概要 |
我々は、以前に、CD169分子を発現するマクロファージの亜集団が消化管粘膜固有層に常在し、腸炎の進展に深く関与することを証明した。このマクロファージはCCL8を産生して炎症性単球を動員し、これがさらなる組織傷害を誘導する。抗CCL8抗体はマウスのデキストラン硫酸誘導大腸炎を抑制することから、CCL8産生誘導機構解明は、腸炎治療法開発にも応用可能と、我々は考えた。骨髄細胞をM-CSFで誘導したマクロファージ（BMDM）に、腸上皮死細胞の培養液を添加すると、LPS刺激に伴うCCL8産生が亢進する。このアッセイ系を利用し、死細胞に由来する、CCL8産生促進物質同定を目指した。
１）これまで、ネクローシスに伴って死細胞から流出するHMGB1が、免疫応答を正に制御することが広く知られていた。しかし我々のアッセイでは、抗HMGB1抗体は、死細胞培養液によるCCL8産生促進効果を阻害しなかった。この結果は、HMGB1がCCL8産生に関与することを否定しないが、死細胞培養液中にはHMGB1以外にも、何らかのCCL8産生促進分子が含まれる可能性を示す。
２）マクロファージは何らかの受容体を用いて死細胞由来炎症促進分子を認識すると推察される。そのような受容体を同定するため、まず、マクロファージ表面分子に対するモノクローナルライブラリーを作製した。そのような抗体のうち、死細胞培養液によるCCL8産生促進効果を減弱するクローンを選別した。それらの抗体を用いたアフィニティー精製と質量分析により、モノクローナル抗体の認識するマクロファージ表面分子を複数同定した。
３）死細胞培養液をサイズ排除クロマトグラフィーで分画化し、CCL8産生促進活性のある分画の絞り込みを試みた。その結果、腸上皮死細胞培養液中には、分子量の異なる複数のCCL8産生調節因子が含まれることを示唆する結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの研究で、CCL8産生に関与するマクロファージ表面分子を複数同定できた。また当初は計画していなかったサイズ排除クロマトグラフィーを用い、CCL8産生を促進する死細胞培養液の画分を絞り込むことができた。以上のことから、本研究は、おおむね初年度の研究計画通りに進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、腸上皮死細胞由来分子の探索を進める。サイズ排除クロマトグラフィーで分画化した死細胞培養液に含まれる、CCL8産生促進分子を質量分析等の手法を用いて同定する。精製に必要なだけの死細胞培養液調製が困難な場合、細胞死を誘導した生体組織抽出液の利用も検討する。例えば、アセトアミノフェン投与マウスの肝臓や、虚血再灌流傷害誘導マウスの腎臓を破砕し、その上清を利用する方法を考えている。目的の死細胞由来分子が同定できた場合、ただちに腸炎進展における役割を解析する。死細胞由来分子に対する中和抗体や、マクロファージ受容体に対する阻害抗体を作製し、DSS 誘導大腸炎マウスに投与して治療効果を検討する。目的の分子がタンパクだった場合は、そのノックアウトマウスを作製する。
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