薬剤耐性マラリアの出現を予測する：加速進化系による包括的実験室進化システムの開発

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H04074
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 美田 敏宏 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80318013)
• 研究分担者: 平井 誠 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50326849)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: マラリア / 薬剤耐性 / ミューテータ / 実験室進化

研究実績の概要

現在の熱帯熱マラリア薬剤耐性研究は、すでに出現・拡散した薬剤耐性原虫を用いることが出発点となっているため、耐性遺伝子を同定しても実際面でのインパクトは弱い。本研究では、通常の50～100倍多く遺伝子変異を起こすミューテータ熱帯熱マラリア原虫による包括的実験室進化システムを開発し、その壁を乗り越える。ミューテータは、DNA複製酵素の校正活性のみを低下させ、本来修復されるエラーをそのままゲノム内に取り込ませることで変異率の上昇を狙ったシステムである。
H29年度は通常より約100倍変異が蓄積する熱帯熱マラリア原虫ミューテータの作製を目標とした。
1）熱帯熱マラリア原虫のDNA合成酵素の校正活性に必須なDNAポリメラーゼδのアミノ酸2ヶ所（D308, E311）は、他の生物の場合と同様に完全に保存されており、申請者らによる先行研究においてネズミマラリア原虫の当該遺伝子の2ヶ所に該当するコドンをアラニンに置換することでミューテータ化に成功しており、熱帯熱マラリア原虫においても同様の方法を試みた。プラスミドを作成後に遺伝子導入を試みたが、安定した形質の発現に至らなかった。
2）DNAポリメラーゼεのノックダウンも酵母の系でミューテータ形質を賦与することが報告されており、組み換え原虫の作成が容易なマウスマラリアで試みた。その結果、安定した形質を持ったミューテータマウスマラリア原虫の作成に成功した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

薬剤耐性原虫の単離実験を予定の8月に開始できなかった。これは、ゲノム編集によって安定した形質を持つDNAポリメラーゼδ組み換え原虫の作成に難渋したためである。その原因として、Cas9自体が目的とするノックダウン原虫の発育を阻害している可能性を発見した。

今後の研究の推進方策

今後の研究の推進方策については変更はない。
当初予定からやや遅れているDNAポリメラーゼδ組み換え原虫の作成については、新しいプラスミドの作成が終了した。すでに新たな遺伝子導入法による実験を実施しており、次年度中に達成が可能である。
ミューテータ原虫の単離に成功したら、アルテミシニン併用療法のパートナー薬として用いられているルメファントリン、ピペラキン、アモディアキン、メフロキンの薬剤圧下で培養し、それぞれの抗マラリア薬に対する耐性原虫を単離する。つぎに、上記併用剤へ耐性化したミューテータ原虫を、さらにARTへ耐性化させていき、いまだ野生では出現してないアルテミシニン併用療法への完全耐性原虫を単離する。
さらに、実集団での薬剤耐性原虫のゲノム解析をすすめ、実験室進化の結果を検証する。われわれはウガンダの調査でアフリカで初めてのアルテミシニン耐性原虫を同定した（Emerg Infect Dis, 2018）。本年度も引き続き調査を実施し、実集団においてどのようなゲノムの変化が起こっているのかを検討する。本結果とミューテータ原虫から得られたアルテミシニン耐性原虫ゲノムの比較により、すでに推定耐性変異は実際のフィールドで出現しはじめているのか、その変異は自然集団ではどれぐらいおこりやすいのかについて検証する。

研究成果

• [雑誌論文] 蚊媒介感染症に関する最近の話題 (2017)
  • 著者名/発表者名: 美田敏宏
  • 雑誌名: 臨床と微生物 巻: 44 ページ: 263－268
• [雑誌論文] Absence of in vivo selection for K13 mutations after artemether-lumefantrine treatment in Uganda. (2017)
  • 著者名/発表者名: Balikagala B, Mita T, Ikeda M, Sakurai M, Yatsushiro S, Takahashi N, Tachibana SI, Auma M, Ntege EH, Ito D, Takashima E, Palacpac NM, Egwang TG, Onen JO, Kataoka M, Kimura E, Horii T, Tsuboi T.
  • 雑誌名: Malar J. 巻: 16 ページ: 23
  • DOI: 10.1186/s12936-016-1663-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 原虫学・寄生虫学が現代のトップサイエンスにもたらす貢献 マラリアミューテーター マラリア原虫薬剤耐性進化解明の新たな研究ツール. (2017)
  • 著者名/発表者名: 平井誠, 池田美恵, 橘真一郎, 美田敏宏.
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会.
• [学会発表] End malaria-マラリアのeliminationをめざして アルテミシニン耐性の評価・検出ツールは出そろったか? 流行地でのフィールド調査から見えてきた問題点. (2017)
  • 著者名/発表者名: 美田敏宏
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会.
  • 招待講演
• [学会発表] 人類を助ける進化学研究：進化し続ける薬剤耐性マラリアの克服. (2017)
  • 著者名/発表者名: 美田敏宏
  • 学会等名: 公益信託 進化学振興木村資生基金 “微生物と人類の共存”をゲノムの視点から考える.
  • 招待講演
• [学会発表] ウガンダにおけるin vivo薬剤耐性試験およびRSAを用いたアルテミシニン耐性疫学調査. (2017)
  • 著者名/発表者名: 池田美恵, 橘真一郎, 山内祐人, Auma M, 関原誠, 森稔幸, 平井誠, Palacpac N, 木村英作, Aginya E, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] ウガンダ国の熱帯熱マラリア患者において腸内細菌叢の変化が起こる. (2017)
  • 著者名/発表者名: 谷口委代, 宮内栄治, OliaAlex, 長安英治, OsbertKaturo, 鈴江一友, 今井孝, 下川周子, 大西里咲, I. O-A, PalacpacNirianne, 丸山治彦, 木村英作, 美田敏宏, 大野博司, 堀井俊宏, 久枝一.
  • 学会等名: グローバルヘルス合同大会プログラム・抄録集.
• [学会発表] ネズミマラリア原虫の有性生殖関連分子の機能解析. (2017)
  • 著者名/発表者名: 前多晟壮, 森稔幸, 平井誠, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] マラリア原虫有性生殖の透視観察法の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 森稔幸, 平井誠, 美田敏宏
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] ウガンダにおける熱帯熱マラリア原虫キニーネ感受性の実態. (2017)
  • 著者名/発表者名: 山内祐人, 橘真一郎, 池田美恵, 関原誠, Balikagala B, 八代-櫻井美樹, 平井誠, Palacpac N, 木村英作, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] 線虫ミトコンドリアのプロテオーム解析 二次元電気泳動法とショットガン質量分析. (2017)
  • 著者名/発表者名: 高宮信三郎, 數野彩子, 峯木礼子, 三浦芳樹, 美田敏宏.
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] Ascaris suum 成虫およびCaenorhabditis elegans ミトコンドリアのプロテオーム解析: 二次元ゲル電気泳動法とショットガン質量分析法. (2017)
  • 著者名/発表者名: 高宮信三郎, 数野彩子, 峯木礼子, 三浦芳樹, 美田敏宏
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] 宿主内競争による熱帯熱マラリア原虫のクロロキン感受性の回復. (2017)
  • 著者名/発表者名: 橘真一郎, 池田美恵, Balikagala B, 櫻井美樹, 八代聖基, 関原誠, 山内祐人, Auma MA, 平井誠, 森稔幸, Palacpac N, 片岡正俊, 木村英作, 堀井俊宏, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] Epidemiology of antimalarial drug resistance in Papua New Guinea. (2017)
  • 著者名/発表者名: 関原誠, 橘真一郎, 美田敏宏.
  • 学会等名: 第86回日本寄生虫学会大会
• [学会発表] Prerequisite Emergence of Background Mutations For Kelch13-Related Artemisinin-Resistant Plasmodium Falciparum Isolates. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tachibana S-I, Mori T, Hirai M, Mita T
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Development of See-Through Imaging Methods for Sexual Reproduction of Malaria Parasites. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mori T, Hirai M, Mita T
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Detection of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum isolates with ex-vivo ring-stage survival assay in Uganda. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mita T, Ikeda M, Kaneko M, Balikagala B, Tachibana S-I, Sakurai-Yatsushiro M, Yatsushiro S, Takahashi N, Hashimoto M, Katuro O, Olia A, Obwoya P, Auma M, Anywar D, Odongo-Aginya E, Hirai M, Palacpac N, Kataoka M, Tsuboi T, Kimura E, Horii T.
  • 学会等名: Keystone Symposia Conference: Malaria:
  • 国際学会
• [学会発表] A mutator Plasmodium berghei model to investigate antimalarial drug resistance. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mita T
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Pb102, A Novel Gene Essential for Female Fertility or Ookinete Maturation of Murine Malaria Parasite, Plasmodium Berghei. (2017)
  • 著者名/発表者名: Maeta A, Hirai M, Mori T, Mita T
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Application of a cell microarray chip system for accurate, highly sensitive, and rapid diagnosis for malaria. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kataoka M, Yatsushiro S, Yamamoto T, Oka H, Okello-Onen J, Odongo-Aginya E, Palacpac N, Mita T, Baba Y, Horii T.
  • 学会等名: Keystone Symposia Conference: Malaria
  • 国際学会
• [学会発表] Isolation of Piperaquine Resistant Rodent Malaria Parasite from Mutator Malaria. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirai M, Ikeda M, Tachibana S-I, Mita T
  • 学会等名: American Society of Tropical Medicine and Hygiene 66th Annual Meeting
  • 国際学会