| 研究課題/領域番号 |
17H04090
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
谷内 一郎 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (20284573)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 転写因子 / 免疫細胞 / タンパク構造 / アミノ酸点変異 |
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| 研究実績の概要 |
Runx/Cbfb転写因子は多様な細胞種の発生・分化プログラムを制御する重要な転写因子である。これまでの研究成果より、Runxタンパク、CbfbタンパクのC末端のアミノ酸配列がRunx/Cbfb複合体の機能制御に極めて重要な役割を果たすことが判明した。本研究提案ではその分子機構の実態を解明することを目的とした研究を行った。特にCbfb2特異的配列とRunxタンパクのC末端のWRPY配列を介した制御機構に着目し、これら配列を介した制御機構の分子実体を解明する。
野生型とCbfb2欠損マウス由来の胸腺細胞を材料とし、抗Cbfb抗体を用いた免疫沈降-プロテオミクス解析を行ったが、Cbfb2と特異的に会合する分子は同定出来なかった。また Cbfb2特異的なSXLL配列を欠損するマウスを作製したが、Cbfb2欠損マウスにみられる特徴的な表現型は観察できず、Cbfb2特異的なRNAスプライシングはCbfbの総タンパク量の調整に関与することが考えられた。
Runx3タンパクのWRPY配列をWRPW、WRPF、WRPEに置換した変異マウスの表現型解析から、Y残基のリン酸化の可能性と表現型へのTLE共役抑制因子の関与が示唆された。Y残基がリン酸化された合成ペプチドとTLEファミリーWDドメインとの親和性測定を行うため、昆虫細胞中でWDドメインの産生を行う発現ベクターの供与を受け、まずは既報の手法でWDドメインの精製を試みたが、専門知識が必要であることが解り、今年度は共同研究により、上記の測定計の構築を行った。またY残基のリン酸化の同定を目的に、モノクロナール抗体の産生を試みた。Runx3-WRPW変異マウスとTLEファミリー変異マウスを交配し、Runx3-WRPW変異マウスの表現型はTLE3欠損により部分的に回復することを確認した。また野生型Runx3と変異型Runx3-WRPWにFlagタグ配列を付加したマウスを作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昆虫細胞中でWDドメインの産生と精製は共同研究者により順調に成功し、野生型WRPW合成ペプチドとの親和性測定においても既報通りの結果が得られたことから、同じ実験型を目的とするリン酸化型合成WRPYペプチド等で行うのみとなったが、この時点で共同研究者が退職となり、後任者に実験系が引き継がれた。その後、後任者では昆虫細胞中でWDドメイン精製過程が不安定となり、測定系が機能しない事態となり、実験条件/手法の再検定を行っている状況である。そこで、チロシン残基のリン酸化の検出法として、ウサギモノクロナール抗体の作成も同時に行うことに方向転換した。現在ELISAでの検定では6羽の免疫したウサギのうち3羽でY残基のリン酸化修飾を持つ合成ペプチドに高い親和性を示すウサギ血清を得ることができている。また、野生型Runx3と変異型Runx3-WRPWタンパクと会合するタンパクをプロテオミクス解析により網羅的に検出する目的で、内在性の両タンパクにFlagタグ配列を付加したマウスの作製にも成功した。
以上、研究実施において生じた幾つかの予想外の困難な状況に対し、適時迅速に対応したが、共同研究者の技量の問題に起因する困難に対応することは難しいことから、研究の進捗はやや遅れていると言わざる得ない。
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| 今後の研究の推進方策 |
昆虫細胞中で精製したWDドメインと合成ペプチドの親和性測定については、早急に実験条件の改善を試みるが、この測定系に固執することなく、WRPY配列のチロシンリン酸化を特異的に認識するウサギモノクロナール抗体の作製に注力する。またマウス由来の細胞を用いた免疫沈降法を利用する。研究の全体的な方向としては、RunxタンパクのC末端構造を介した制御機構の解明においては、Runx3-WRPW変異マウスの表現型を回復する遺伝学的手法（TLE変異マウスや活性型STAT5トランスジェニックマウスとの交配）による結果はある程度得られていることから、今後は生化学的、分子生物学的解析に焦点を絞り研究を行う。特に、最後のチロシン残基のリン酸化の検出と責任キナーゼの同定を行いたい。また新たにHes1タンパクのWRPW配列をWRP及びWRPYに置換したマウスを作製したのでその表現型解析を行い、逆の方向への相補的な変異導入がHes1タンパクの機能にどの様な影響を及ぼすか解析する
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