| 研究課題/領域番号 |
17H04102
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
伊藤 孝司 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (00184656)
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| 研究分担者 |
辻 大輔 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 助教 (00423400)
広川 貴次 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究チーム長 (20357867)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | バイオ医薬品 / 糖タンパク製剤 / リソソーム病 / ドラッグデリバリー / 糖鎖工学 |
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| 研究実績の概要 |
1.つくば農研機構との共同で作製した、ヒトリソソーム性カテプシンA（CTSA）を後部絹糸腺で高発現する組換えカイコの繭から精製した、末端マンノース残基（Man）含有糖鎖付加型のCTSA前駆体タンパク質を、スプライシング異常誘導型Ctsa劣性変異導入（Ctsa及びNeu1同時欠損）ガラクトシアリドーシスモデル（GS）マウス脳由来の初代培養ミクログリアに投与すると、細胞表面のManレセプター（ManR）を介して取り込まれ、Ctsa及びNeu1活性を回復させるとともに、蓄積Neu1基質である末端シアル酸含有糖鎖を減少させることを明らかにした。
2.ヒトCTSA前駆体タンパク-6xHisタグ付きを高発現するCHO細胞の培養上清から精製し、成体GSマウスの脳室内に単回投与すると、脳構成細胞内に取り込まれ、Ctsa及びNeu1活性が一過的に回復することを明らかにした。またGS患者由来繊維芽細胞株の培養液に添加すると、マンノース6-リン酸レセプター（M6PR）との結合を介して細胞内に取り込まれた後、リソソームへと輸送され、欠損しているCtsa及びNeu1活性が回復した。しかしリソソーム内半減半減期は短く、24時間程度と推定された。
3.ムコ多糖症１型（MPS1）の責任酵素である、α-イズロニダーゼ（IDUA）を絹糸腺で高発現する組換えカイコの繭から、活性型IDUAを簡便に抽出・精製し、N型糖鎖転移酵素を用いた末端M6P含有合成糖鎖付加IDUAは、MPS1患者由来線維芽細胞内に取り込まれ、蓄積ヘパラン硫酸が減少させることを明らかにした。また2017年度に京都大霊長類研究所との共同で発見した、自然発症IDUA欠損症ニホンサル家系において、酵素診断により疾患個体をさらに見いだすことができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで治療薬がない、リソソーム病の一種であるヒトCTSA欠損症（ガラクトシアリドーシスGS）のモデルマウスの脳由来初代培養ミクログリアに対して、連携研究者の瀬筒秀樹博士、立松謙一郎博士らが作製した、ヒトCTSA遺伝子を絹糸腺で高発現する組換えカイコ繭の供給を受け、繭から精製したCTSA前駆体がManRを介して取り込まれ、有効性を示すこと、また脳室内単回投与により、活性化ミクログリアや神経炎症の抑制効果をもつことを明らかにできた。またヒトCTSA-6xHis高発現・分泌する哺乳類CHO細胞株の培養上清から精製した組換えCTSA-6xHisを、GSマウスに脳室内に投与すると、CTSA前駆体タンパク質に付加される末端M6P含有糖鎖とM6PRを介して脳構成細胞内に取り込まれ、欠損Ctsa及びNeu1活性を回復させることができた。さらにIDUA発現組換えカイコの繭から精製したヒト酵素に、末端M6P含有合成糖鎖を付加でき、IDUA欠損細胞内に取り込ませ、蓄積基質を分解・減少させる技術を開発できたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度以降は、ヒトCTSA遺伝子を恒常発現する組換えカイコまたは哺乳類CHO細胞株の培養上清から精製するヒトCTSA前駆体タンパク質を、GSマウスの脳室内（脳脊髄液）または静脈内に投与し、同マウスの中枢神経症状及び末梢症状に対する有効性を検討していく。
また自然発症ムコ多糖症１型（IDUA欠損症）ニホンザル個体に、IDUA発現組換えカイコの繭由来ヒト酵素の糖鎖改変体を静脈内投与し、有効性と安全性評価を検討していく予定である。
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