研究課題/領域番号 |
17H04103
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研究機関 | 九州大学 |
研究代表者 |
家入 一郎 九州大学, 薬学研究院, 教授 (60253473)
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研究分担者 |
廣田 豪 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (80423573)
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研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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キーワード | CYP3A4 / DNAメチル化 / バイオマーカー |
研究実績の概要 |
薬物代謝酵素cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) は、臨床現場で使用される薬物の半数以上を基質とするが、発現量には約50倍、活性には数十倍の個人差が存在している。当研究室では、ヒトCYP3A4遺伝子の数Mb下流のCpG islandにおいてCG siteのDNAメチル化頻度に、大きな個人差が存在することを確認した (この領域をdifferentially methylated region: DMRとする)。DMRにおけるDNAメチル化頻度とCYP3A4発現量との間に有意な負の相関があることから、DNAメチル化頻度はCYP3A4活性を予測する新たなバイオマーカーとなることが示唆されている。平成29年度は、CYP3A4バイオマーカー確立のためのヒト臨床試験への準備段階として、末梢血から肝由来細胞を分取し、DNAメチル化を解析する方法の構築を試みた。 末梢血からの肝細胞分離法として、血球特異的な抗原を標的にした免疫磁気分離を行うことで、血球細胞を除去した上で、肝特異的な膜タンパクを利用した免疫沈降を行い肝細胞を分離する方策を構築した。分離細胞の肝特異性を確認するため、GSTP1遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化を行った。その結果、分離細胞は肝細胞に特徴的な高いDNAメチル化頻度を示した。また、同分離細胞は肝細胞に強く発現するmiR-1915の発現量がバフィーコートと比べ有意に高かった。以上より、構築した分離法により肝由来細胞を分取できたことが示唆された。 本研究で構築した末梢血から肝由来細胞を分離する手法は、他に前例がなく独創的である。また、各組織に特異的な膜抗原を選択することで、肝臓以外の組織においても低侵襲的に目的臓器の細胞を獲得できることから、普遍的な手法となる可能性があると思われる。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題において、最も重要であり困難が予想された末梢血からの肝細胞の分離方法の構築が概ね順調に進んだことから、平成29年度の進捗状況に問題はないと思われる。臨床試験への展開を考慮すると、分離方法は簡便であり頑強性の高いものである必要があるが、構築した分離法は比較的シンプルな方法に基づくことから、この点においても大きな問題はない。
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今後の研究の推進方策 |
平成30年度以降は、DNAメチル化診断の定量精度の向上を目指した新規解析法の構築を行った上で、末梢血からの肝細胞分離法を用いたヒトを対象とした臨床試験を行う予定である。 これまでに汎用されているDNAメチル化診断法は、バイサルファイトPCRに基づく定性的な方法である。定量的なDNAメチル化解析を実現するため、ICON probeを使用したリアルタイムPCRを応用する新たなDNAメチル化解析法を構築する。ICONプローブによるPCRでは、任意のCpG siteがDNAメチル化状態である場合、標的シトシンとICONプローブとの間に、オスミウムを介した錯体を形成する。形成した錯体は、PCRにおいて増幅効率に低下させることから、増幅効率を測定することでDNAメチル化頻度を定量的に評価することができる。バイサルファイト処理を行わず、real PCRにより直接ゲノムDNAの解析を行うため、バイサルファイト変換エラーやDNA分解などのDNAメチル化解析における既存の問題を解決することができる。 定量的なDNAメチル化解析法を構築した後、CYP3Aの典型的な基質薬物であるミダゾラムを投与し、経時的な採血を行い血中濃度測定・解析を行うことで、DMRにおけるDNAメチル化がCYP3A4活性の予測バイオマーカーとして妥当であるのか検証する。
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