機能性一本鎖抗体の創製と終末糖化産物による疾患メカニズムの解明

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H04105
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 森岡 弘志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (20230097)
• 研究分担者: 竹内 正義 金沢医科大学, 総合医学研究所, 教授 (20154982) ; 小橋川 敬博 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (90455600) ; 佐藤 卓史 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (70555755)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 一本鎖抗体 / 終末糖化産物 / プロテオーム解析 / バイオマーカー / 糖尿病性腎症

研究実績の概要

生体内のタンパク質が糖化されてできる終末糖化産物（AGEs）は、加齢や高血糖状態の持続により蓄積され、AGEs受容体の一種であるRAGE（Receptor for AGEs）に結合し、糖尿病合併症などの生活習慣病に強く関与すると考えられている。本研究では、AGEs構造を特異的に識別する一本鎖抗体（scFv）にβグルカン認識タンパク質（βGRP）を結合させた機能性一本鎖抗体（scFv-GRP融合抗体）を調製し、それらを用いて血液中に存在するAGEs修飾されたタンパク質の選択的な分離・濃縮を行った。さらに、質量分析法によるプロテオーム解析によって、濃縮された糖化タンパク質の同定を行い、AGEs関連疾患の診断・予防に有用なバイオマーカーの探索を進めている。
大腸菌を用いた遺伝子発現システムで、AGEs抗原としてGA-pyridineおよびCMLに特異的な73MuL9scFv-GRPおよびCMLscFv-GRPを調製した。これらの融合抗体とカードランビーズを用いたアフィニティーシステム（免疫沈降法）を構築し、非特異的吸着が極めて少ない工程で、健常人の血清試料中から様々なGA-pyridine修飾タンパク質およびCML修飾タンパク質を濃縮することに成功した。
それらの濃縮液をWestern blottingによって解析した結果、GA-pyridineおよびCML修飾タンパク質が特異的に濃縮されていることが確認できた。特に、GA-pyridine特異的な73MuL9scFv-GRP融合抗体を用いた実験から、LC-MS/MS測定後、UniProt human proteome databaseにより107種類のタンパク質が同定された。
現在、標的タンパク質の選択ならびに免疫沈降の改善方法の検討を行っており、LC-MS/MS解析により糖化修飾部位の決定のための研究を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

GA-pyridineおよびCMLに特異的なscFv-GRP融合抗体それぞれの調製方法を改良し、研究遂行に必要な十分量の機能性融合抗体を精製することが可能となった。健常人の血清および血漿試料を用いて、GA-pyridineならびにCML修飾された血清タンパク質の分離・濃縮を行ったところ、生体内物質の非特異的吸着が極めて少ない優れた方法であることが示された。現在、質量分析法によるプロテオーム解析を続けており、標的タンパク質の選択、ならびに、糖化タンパク質の糖化部位の同定を進めている。
一方、TAGEの化学構造の決定に関しては、現時点では未だ明らかにされていない。ペプチド合成用試薬であるベンジルオキシカルボニルリジン（Z-Lys）を原料にして、グリセルアルデヒド（GCA）を反応させ、TAGEを含むAGEs混合物を得た後、逆相HPLC による分離・分画、TAGE特異的抗体を用いた競合ELISAによる抗体結合活性を指標とした生成物の分離を進めている。AGEs混合物の中に抗体結合活性が認められているが、単一ピークとしての分画には至っておらず、今後はHPLCの分離条件等の検討が必要となっている。
また、TAGE特異的抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列を決定し、遺伝子操作によりscFv抗体の調製を行った。現在、TAGEscFv-GRP融合抗体遺伝子の作製を進めている。
さらに、AGEs-RAGE病因説を立証するため、遺伝子組み換え型RAGEのリガンド結合ドメインの調製を行い、現在、GA-pyridine修飾されたアミノ酸との分子間相互作用を物理化学的手法（DSF）により解析している。

今後の研究の推進方策

健常人の血液試料を用いた実験で、GA-pyridineおよびCML糖化修飾タンパク質の分離・濃縮方法を確立することができたので、今後は糖尿病合併症（腎症）の臨床検体から、同様に糖化修飾タンパク質の分離・濃縮を行う。質量分析法によるプロテオーム解析を進め、特定された糖化タンパク質の種類と検体の臨床検査データとの相関を精査しながら、AGEs関連疾患の診断・予防に有用なバイオマーカーの探索を行う。
一方、TAGEに関しては、その化学構造の解析を引き続き行う。また、TAGE特異的なscFv抗体に関しては、ファージディスプレイ法により高品質なTAGE特異的scFv抗体の獲得を進める。さらに、TAGE特異的な機能性一本鎖抗体（TAGEscFv-GRP融合抗体）を調製し、上記同様の臨床検体を用いて、TAGE修飾された血清タンパク質の分離・濃縮、質量分析法によるプロテオーム解析を行い、バイオマーカーの探索を行う。
また、AGEs-RAGE病因説を立証するため、GA-pyridineならびにTAGE修飾されたアミノ酸を用いて、細胞応答、細胞障害、酸化ストレス作用などを生化学・細胞生物学的に解析すると同時に、遺伝子組み換え型RAGEのリガンド結合ドメインとの分子間相互作用の詳細を物理化学的手法（DSF、ITC、NMR等）により解析する。得られたデータを総合的に解析・評価することで、糖尿病関連疾患の発症・進展の分子メカニズムを明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Development of an immunoassay for fluvoxamine detection using a recombinant single-chain variable fragment antibody (2017)
  • 著者名/発表者名: Sasao Ako, Takaki Michiyo, Ohtsu Yuki, Mishima Satoko, Yonemitsu Kosei, Morioka Hiroshi, Nishitani Yoko
  • 雑誌名: Forensic Toxicology 巻: 35 ページ: 301～308
  • DOI: doi:10.1007/s11419-017-0358-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of Single-Chain Fv Antibodies Specific for GA-Pyridine, an Advanced Glycation End-Product (AGE), with Reduced Inter-Domain Motion (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda N, Noi K, Weng LD, Kobashigawa Y, Miyazaki H, Wakeyama Y, Takaki M, Nakahara Y, Tatsuno Y, Uchida-Kamekura M, Suwa Y, Sato T, Ichikawa-Tomikawa N, Nomizu M, Fujiwara Y, Ohsaka F, Saitoh T, Maenaka K, Kumeta H, Shinya S, Kojima C, Ogura T, Morioka H
  • 雑誌名: Molecules 巻: 22 ページ: 1695
  • DOI: doi:10.3390/molecules22101695
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] NMR解析に向けた終末糖化産物の１種であるGA-pyridineに対する一本鎖抗体（scFv）の創製 (2018)
  • 著者名/発表者名: 翁 力棟，宮﨑広海，分山結加里，中原悠介，福田夏希，佐藤卓史，小橋川敬博，野井健太郎，小椋 光，久米田博之，前仲勝実，森岡弘志
  • 学会等名: 第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
• [学会発表] ヒストン翻訳語修飾体を標的とする一本鎖抗体の機能評価 (2018)
  • 著者名/発表者名: 寺本真香，池口友佳，福田夏希，佐藤卓史，小橋川敬博，木村 宏，森岡弘志
  • 学会等名: 第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
• [学会発表] GA-pyridineを認識するフラグメント抗体（Fv-clasp）の結晶構造解析及び抗原認識機構の物理化学的解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 豊田湧也，大原隼也，森田光佑，有森貴夫，佐藤卓史，小橋川敬博，中村照也，山縣ゆり子，高木淳一，森岡弘志
  • 学会等名: 第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
• [学会発表] 実用化に向けた安定な一本鎖抗体の創製 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山内聡一郎，福田夏希，寺本真香，佐藤卓史，小橋川敬博，野井健太郎，小椋 光，森岡弘志
  • 学会等名: 第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
• [学会発表] 大腸菌発現系を用いた一本鎖抗体の効率的試料調製法に関する研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 劉 宸江，豊田湧也，福田夏希，佐藤卓史，小橋川敬博，森岡弘志
  • 学会等名: 第5回生命分子科学研究会 Biomolecular Science Meeting
• [学会発表] 一本鎖抗体を用いたAGEs修飾タンパク質の分離・濃縮法の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山内聡一郎，福田夏希，佐藤卓史，増田 豪，堀内正隆，小橋川敬博，大槻純男，森岡弘志
  • 学会等名: 第12回日本ケミカルバイオロジー学会年会
• [学会発表] 高品質な一本鎖抗体の創製に向けた物理化学的手法による評価 (2017)
  • 著者名/発表者名: 森岡弘志
  • 学会等名: 第3回蛋白質工学研究会ワークショップ
  • 招待講演
• [学会発表] 高品質な一本鎖抗体の創製と血清AGE修飾タンパク質の解析，第49回若手ペプチド夏の勉強会 (2017)
  • 著者名/発表者名: 森岡弘志
  • 学会等名: 第49回若手ペプチド夏の勉強会
  • 招待講演
• [学会発表] NMR解析に向けた終末糖化産物の１種であるGA-pyridineに対する一本鎖抗体（scFv）の創製 (2017)
  • 著者名/発表者名: 翁 力棟，宮﨑広海，分山結加里，中原悠介，福田夏希，佐藤卓史，小橋川敬博，森岡弘志
  • 学会等名: 第41回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム
• [学会発表] 終末糖化産物GA-pyridineに対する一本鎖抗体の抗原特異性と親和性の評価 (2017)
  • 著者名/発表者名: 森田光佑，小谷俊介，中島 誠，福田夏希，佐藤卓史，小橋川敬博，森岡弘志
  • 学会等名: 2017年度 生命科学系学会合同年次大会（第40回日本分子生物学会年会、第90回日本生化学会大会）ConBio2017
• [学会発表] 一本鎖抗体融合分子を用いた血清AGEs修飾タンパク質の分離・濃縮法の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 福田夏希，山内聡一郎，早野 翼，佐藤卓史，増田 豪，堀内正隆，小橋川敬博，大槻純男，森岡弘志
  • 学会等名: 2017年度 生命科学系学会合同年次大会（第40回日本分子生物学会年会、第90回日本生化学会大会）ConBio2017
• [備考] 熊本大学 大学院生命科学研究部 生命分析化学分野
  • URL: http://seimeibunseki.org
• [産業財産権] 終末糖化産物に対する抗体およびその使用 (2017)
  • 発明者名: 竹内 正義，山本 哲郎，土田 仁美，森岡 弘志，山内 聡一郎
  • 権利者名: 竹内 正義，山本 哲郎，土田 仁美，森岡 弘志，山内 聡一郎
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2017-168387